[發(fā)明專利]一種腫瘤壞死因子相關凋亡配體變體及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710133862.1
• 申請日: 2007-10-23
• 公開（公告）號: CN101157729A
• 公開（公告）日: 2008-04-09
• 發(fā)明（設計）人: 華子春;曹林
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;A61K38/16;A61P35/00;C12N15/62
• 代理公司: 南京知識律師事務所
• 代理人: 胡錫瑜

一、技術領域：

本發(fā)明屬生物技術領域。

二、背景技術：

腫瘤壞死因子相關凋亡配體(TRAIL)是腫瘤壞死因子超家族中的一個成員。與腫瘤壞死因子超家族其它成員類似，可溶性形式的腫瘤壞死因子相關配體以三聚體形式與靶細胞表面三聚體化的受體分子結合而發(fā)揮起生物學功能。腫瘤壞死因子相關凋亡配體誘導凋亡的作用是通過與腫瘤細胞上的死亡受體4(DR4)和死亡受體5(DR5)的相互作用傳遞死亡信號而實現的。雖然腫瘤壞死因子超家族的其它成員由于具有全身性的毒副作用而使應用受到限制，但是腫瘤壞死因子相關凋亡配體是一個相對的安全、具有腫瘤選擇性的抗腫瘤物質。腫瘤壞死因子相關凋亡配體在體外能誘導多種腫瘤細胞和癌化細胞的凋亡，并且在小鼠的移植異種腫瘤，包括結腸癌、乳腺癌、多重性骨髓瘤、神經膠質瘤、前列腺癌等多種模型中具有較好的抗腫瘤活性。尤其重要的是，在小鼠和非人類靈長類動物中全身給藥時，TRAIL表現出較小或沒有毒性。基于以上原因，重組腫瘤壞死因子相關凋亡配體已經在進行腫瘤治療的臨床研究。

但是近來一些報道顯示：除了誘導腫瘤細胞的凋亡外，腫瘤壞死因子相關凋亡配體還涉及到天然免疫和獲得性免疫，和自身免疫性疾病相關。例如，近來的研究報道表明它在胸腺的發(fā)育過程中調節(jié)負向選擇或凋亡胸腺細胞，并且在誘發(fā)自體免疫性疾病如I型糖尿病中起重要作用。此外，腫瘤壞死因子相關凋亡配體的受體在整個身體廣泛性表達，腫瘤壞死因子相關凋亡配體還參與肝細胞死亡和肝炎。因此在臨床上重復、全身性使用大劑量外源性腫瘤壞死因子相關凋亡配體蛋白可能會導致不可預料的免疫結果。這些報道使科學家非常擔心腫瘤壞死因子相關凋亡配體在臨床中重復和持久使用時產生潛在的副作用。如何在腫瘤治療時，避免腫瘤壞死因子相關凋亡配體對其它組織的毒副作用，這是腫瘤壞死因子相關凋亡配體(TRAIL)在潛在的臨床應用中面臨的難題。

三、發(fā)明內容：

為克服野生型腫瘤壞死因子相關凋亡配體在腫瘤治療方面所面臨的缺陷，本發(fā)明目的在于：發(fā)明一種腫瘤組織靶向性的腫瘤壞死因子相關凋亡配體變體，將其靶向輸送到腫瘤組織中，以此提高腫瘤壞死因子相關凋亡配體的療效，降低其毒副作用。

為達到上述目的，本發(fā)明的技術方案是通過基因工程方法構建由αVβ3、αVβ5整合素的配體、連接肽、腫瘤壞死因子相關凋亡配體組成的腫瘤壞死因子相關凋亡配體變體融合蛋白質，即利用常規(guī)基因工程方法通過人工合成或者克隆構建腫瘤壞死因子相關凋亡配體變體的編碼基因、可溶性地重組表達和簡便地分離純化。其中連接肽為2-20個氨基酸殘基。

進一步地，αVβ3、αVβ5整合素的配體可以是一種含有RGD序列的多肽。

進一步地，αVβ3、αVβ5整合素的配體可以是一種帶有環(huán)柄狀結構的、含有RGD序列的多肽，例如短肽ACDCRGDCFC。

進一步地，由αVβ3、αVβ5整合素配體和腫瘤壞死因子相關凋亡配體組成腫瘤壞死因子相關凋亡配體變體在制備腫瘤治療藥物中的應用。

進一步地，腫瘤壞死因子相關凋亡配體變體制備的腫瘤治療藥物與現有化療、放療、中藥治療、生物治療等方法在腫瘤治療中的聯合運用。

進一步地，一種在大腸桿菌中可溶性表達和簡便分離純化高含量腫瘤壞死因子相關凋亡配體及其變體的聚體的方法。盡管目前腫瘤壞死因子相關凋亡配體在大腸桿菌中表達多為無生物活性的包涵體產物，而本發(fā)明中的腫瘤壞死因子相關凋亡配體變體的分子結構和分子量比野生型腫瘤壞死因子相關凋亡配體更為復雜，因此在大腸桿菌中表達時，其包涵體形成將更為嚴重、純化將更為復雜。本發(fā)明采用了低溫下培養(yǎng)和誘導表達腫瘤壞死因子相關凋亡配體變體的表達方法，使得表達產物有效避免了包涵體的形成；本發(fā)明同時利用了腫瘤壞死因子相關凋亡配體具有鏊合金屬離子的生物功能，利用金屬親和層析和離子交換層析相結合使得腫瘤壞死因子相關凋亡配體及其變體得到了有效的純化、獲得了高純度的蛋白質產物，而且純化產物具有高比例的聚體形式，因此具有非常好的生物活性。其中低溫指35℃-10℃。

整合素αVβ3、αVβ5在休眠期細胞和正常的血管細胞中表達量極低，然而在多種腫瘤細胞(例如：黑色素瘤，結腸癌，乳腺癌，子宮癌)和腫瘤血管內皮細胞表達量顯著上調。上述由αVβ3、αVβ5整合素配體、腫瘤壞死因子相關凋亡配體組成的腫瘤壞死因子相關凋亡配體變體可以大大提高腫瘤壞死因子相關凋亡配體在腫瘤組織中的分布、實現腫瘤壞死因子相關凋亡配體在腫瘤組織中的靶向輸送、大大提高腫瘤壞死因子相關凋亡配體的抗腫瘤效果、同時顯著降低腫瘤壞死因子相關凋亡配體的用量。