[發明專利]一種人胚胎干細胞的培養方法

無效

• 申請號: 200710123000.0
• 申請日: 2007-07-06
• 公開（公告）號: CN101338301A
• 公開（公告）日: 2009-01-07
• 發明（設計）人: 李凌松
• 申請（專利權）人: 李凌松
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08
• 代理公司: 北京元中知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 王明霞

技術領域

本發明涉及細胞培養方法，特別涉及到一種人胚胎干細胞的培養方法。

背景技術

干細胞是存在于發育階段或成體階段多細胞器官中的一群特殊細胞，它們最為顯著的特征是具有無限的自我更新以及分化產生各種子代細胞的雙重能力，統稱為干性(stemness)。胚胎干細胞(Embryonic?Stem?Cell，ES)由受精卵發育成囊胚的內細胞團中而來，是最原始的干細胞，具有分化上的全能性，可以分化成各種構成人體任何一種器官或組織的組成細胞。

1998年美國的Thomson成功分離建立了具有多潛能和永久增殖能力的人胚胎干細胞(hESC)系。最終人胚胎干細胞系的建立，引起了各國政府和研究人員的極大興趣，這項研究分別被美國《SCIENCE》雜志和《TIMES》周刊評為1999年和20世紀末世界十大科技成就之首。人ES細胞具有分化成內、中、外各個胚層所有類型細胞的能力，有向各種組織分化的潛力，人們不僅可以獲得需要的細胞，也有希望獲得某個器官，甚至用基因改造的人ES細胞培育出沒有排斥反應的細胞、組織、器官；另外，人胚胎干細胞為研究藥物對胚胎組織的毒性提供了一個很好的體外實驗模型。

起初用于ES細胞培養增殖的小鼠胚胎成纖維細胞來自妊娠12.5-14.5天的小鼠胚胎，在培養4-5代時用作飼養層，但是小鼠胚胎成纖維細胞(mouse?embryonic?fibroblast，MEF)在體外增殖能力差，且隨傳代次數的增加，其支持人ES細胞生長的能力降低，需要不斷制備原代細胞。而小鼠胚胎成纖維細胞在5-6代后即已老化，況且不同批次的MEF對ES細胞的支持能力不同。更重要的是由于鼠源性的小鼠胚胎成纖維細胞可能引起動物源性病原體或支原體的污染。很多研究組嘗試用各種人源細胞直接作為飼養層或制備條件培養基，如胎兒肌肉細胞、胎兒皮膚成纖維細胞、成人法羅皮奧羅氏管上皮細胞、包皮成纖維細胞、成人骨髓細胞、成人子宮內膜細胞、成人乳房實質細胞、人胚胎成纖維細胞、人胎盤成纖維細胞。然而并不是所有人源細胞都能很好的支持人ES細胞，然而用異體基因來源的細胞仍存在一定交叉污染危險。

同時，基于飼養層的培養需要飼養細胞和干細胞同時生長，由此可能導致出現混合細胞群體，給分離帶來困難，于是后來科學家嘗試無飼養層的培養方法，在無飼養細胞體系中生長干細胞，能夠很容易地從表面分離人胚胎干細胞。

目前最常用的人ES細胞的無飼養層培養方法是2001年美國Geron公司開發的(Xu?C.Nat?Biotechnol，19(10)：971-974.2001)，在他們的實驗中，考慮到了人胚胎干細胞在存活和生長過程中對胞外基質及MEF所分泌因子的依賴性，將人胚胎干細胞接種于胞外基質Matrigel包被的培養皿。Matrigel是BD公司生產的一種從小鼠肉瘤中抽提得到的可溶性基底膜抽提物，主要成份是層粘蛋白(laminin)，還有膠原IV、巢蛋白(entactin)、硫酸肝素糖蛋白，此外還含有一些微量的生長因子，例如表皮生長因子(即epidermal?growth?factor，EGF)、轉化生長因子-β(transforminggrowth?factor-β，TGF-β)、纖維母細胞生長因子(FGF)、組織纖溶酶原激活物(tPA)等。在室溫下，Matrigel可聚合成一種具有生物活性的基質材料，作用與哺乳動物細胞基底膜類似。實驗證明，Matrigel能很好的能支持人胚胎干細胞的生長，經過長期培養的人胚胎干細胞仍然保持正常的核型、各胚層分化能力。美國專利US20030017589中也采用了上述方法。

但是上述方法存在以下問題：a、成本較高；b、操作復雜；c、由于matrigel仍然是一種鼠源組分，應用時易引發人體免疫反應導致移植失敗。

本發明申請經過大量實驗，用gelatin來代替matrigel，克服了以上種種缺點。與matrigel相比，gelatin有以下優點：

a價格非常便宜；

b操作更加簡便；

c來源于豬皮水解產物，應用更安全。

發明內容

本發明的目的在于提供一種人胚胎干細胞的培養方法。

本發明的另一目的在于提供一種用上述方法制備的人胚胎干細胞系。

本發明提供的人胚胎干細胞的培養方法是通過以下步驟實現的：

a、人胚胎干細胞的消化，和；

b、將消化后的人胚胎干細胞接種于培養基包被的培養皿上，所述培養基包被的培養皿為：將Gelatin水溶液均勻鋪滿培養皿，室溫靜置后，吸出Gelatin水溶液；