[發明專利]一種微囊藻毒素單克隆抗體及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 200710119212.1
• 申請日: 2007-07-18
• 公開（公告）號: CN101125889A
• 公開（公告）日: 2008-02-20
• 發明（設計）人: 何苗;盛建武;施漢昌
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;G01N33/577;C12N5/18
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及一種微囊藻毒素單克隆抗體及其制備方法與應用。

背景技術

水體富營養化致使藻類異常增殖并釋放微囊藻毒素(Microcystins，MCs)，其中微囊藻毒素-LR(Microcystin-LR，MC-LR)是目前已知急性毒性最強、危害最大的一種淡水藍藻毒素。微囊藻毒素-LR是一組環狀七肽，其化學結構式如式I所示：

(式I)

微囊藻毒素水華的頻繁暴發嚴重威脅著生態安全和人類的飲水安全，因此，對水中微囊藻毒素及時準確的監測非常重要。免疫檢測是基于抗原-抗體特異性反應的檢測方法，具有特異性強、靈敏度高、分析通量大、檢測速度快和費用低廉等優點，在微囊藻毒素的大規模樣品快速篩查和預警監測方面具有廣闊的應用前景。

免疫檢測技術的關鍵在于獲得特異性和親和力良好的抗體，即抗體是免疫檢測技術的關鍵。特別是對于微囊藻毒素等分子量小于5000的小分子有機污染物(其中，微囊藻毒素-LR的分子量為995.2)，免疫原性很弱或不具備免疫原性，不能刺激動物機體產生抗體，只有與大分子載體物質偶聯形成完全抗原，才能促使動物機體產生免疫反應，從而獲得抗體。另外，利用合成的完全抗原免疫動物，其目的是需要盡可能多地獲得針對完全抗原上小分子的抗體，并盡量減少針對載體物質的抗體。因此，所獲抗體的質量在很大程度上還取決于免疫方案的設計和優化。

目前有關微囊藻毒素抗體制備的文獻報道中，所獲得抗體的質量各不相同，主要表現在以下兩方面：首先是抗體所表現出來的特異性各不相同，并且還未見有只針對微囊藻毒素-LR特異性非常強的抗體的報道，同時也未見能與所有藻毒素類似物都有較好的交叉反應的抗體報道；其次是所報道的抗體親和力各不同，檢測限和定量檢測區間也存在較大差別。因此，抗體是決定微囊藻毒素免疫檢測大規模應用的瓶頸。

發明內容

本發明的目的是提供-種微囊藻毒素單克隆抗體及其制備方法，即微囊藻毒素-LR單克隆抗體及其制備方法。

該微囊藻毒素-LR的單克隆抗體按照包括以下步驟的方法制備：

1)在微囊藻毒素-LR的第七位氨基酸殘基N-甲基脫氫丙氨酸上引入一個氨基，得到經氨基修飾的微囊藻毒素-LR；將該經氨基修飾的微囊藻毒素-LR與載體蛋白偶聯得到完全抗原A；

2)將步驟1)的完全抗原A免疫小鼠，取免疫小鼠的脾細胞，與小鼠骨髓瘤細胞融合，篩選出陽性雜交瘤細胞株；培養所述陽性雜交瘤細胞株或將所述陽性雜交瘤細胞株注入同系小鼠腹腔誘生腹水，得到微囊藻毒素-LR的單克隆抗體。

其中，所述步驟1)中，用2-巰基乙胺在微囊藻毒素-LR的第7位氨基酸殘基上引入一個氨基。所述完全抗原A中的載體蛋白可為任意一種常用的載體蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、鑰孔血藍蛋白(KLH)或卵清白蛋白(OVA)等大分子白蛋白，優選為牛血清白蛋白；所述偶聯方法可采用常規的戊二醛法或N-琥珀酰亞胺法等。

所述步驟2)中用于免疫的小鼠具體可為Balb/c小鼠；免疫方法為：每只小鼠每次免疫所用的所述完全抗原劑A量為15-40μg，兩次免疫的間隔時間為20-40天；免疫方式為皮下多點注射；

所述步驟2)中的小鼠骨髓瘤細胞具體可為小鼠骨髓瘤細胞SP2/0。

所述步驟2)中的篩選陽性雜交瘤細胞株的方法具體可為：先用包被抗原篩選1-2次，再用微囊藻毒素-LR單體篩選至少1次；所述包被抗原為將所述步驟1)中的經氨基修飾的微囊藻毒素-LR多肽與載體蛋白偶聯得到的完全抗原B；所述完全抗原B與所述完全抗原A中的載體蛋白不相同；

當完全抗原A中的載體蛋白為牛血清白蛋白時，所述完全抗原B中的載體蛋白具體可為人血清白蛋白、鑰孔血藍蛋白或卵清白蛋白。

本發明利用上述免疫方法和篩選方法，用合成的完全抗原免疫小鼠，得到了只針對完全抗原上小分子微囊藻毒素-LR的抗體。

所述陽性雜交瘤細胞株具體可為能分泌抗Microcystin-LR單克隆抗體的小鼠雜交瘤細胞株MC8C10，其保藏號為CGMCC?No.2101。

所述方法中還可包括純化所述單克隆抗體的步驟，將上述腹水或上層培養液分離純化后，即獲得抗微囊藻毒素的單克隆抗體。

為提高單克隆抗體的純度，可用免疫親和層析方法對其進行純化，尤以HiTraprProtein?A?FF?1mL免疫親和層析柱的純化效果好。

所述微囊藻毒素-LR的單克隆抗體，具體可由保藏號為CGMCC?No.2101的小鼠雜交瘤細胞株MC8C10產生。