[發(fā)明專利]一種冬瓜蛋白酶的純化方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710114209.0
• 申請日: 2007-11-12
• 公開（公告）號: CN101182504A
• 公開（公告）日: 2008-05-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 惠靜璇
• 申請（專利權(quán)）人: 惠靜璇
• 主分類號: C12N9/50
• 分類號: C12N9/50
• 代理公司: 青島高曉專利事務(wù)所
• 代理人: 隋臻瑋;于正河

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種冬瓜蛋白酶的純化方法，屬于輕工食品領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

冬瓜(Benincasa?hispida?Cogn.)，別名白瓜、枕瓜、廣瓜，原產(chǎn)我國南方和印度，屬葫蘆科植物，全國各地均有栽培。冬瓜營養(yǎng)豐富、耐貯藏、肉質(zhì)潔白、脆爽多汁，且還具有利尿、清熱、化痰、解渴等功效，因而一直被奉為物美價廉、藥食兼用的佳品而受到消費者的青睞。

蛋白酶是一類專一水解蛋白質(zhì)的酶，因其作用底物特異、催化效率高而使其在醫(yī)藥、食品、化工、飼料、紡織等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，是少數(shù)幾種已形成產(chǎn)業(yè)化的酶制劑之一。蛋白酶制劑的原料主要有動物、植物和微生物，且以微生物為主。不同來源的蛋白酶用途不同，植物來源的蛋白酶由于其酶學(xué)性質(zhì)、生產(chǎn)成本等特點使其在應(yīng)用上有著微生物蛋白酶無法替代的優(yōu)勢。因此，人們對植物蛋白酶的開發(fā)利用從未停止過。

目前國內(nèi)外對植物蛋白酶的生產(chǎn)和利用主要限于木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶，季本仁等在所申請的專利中公開了一種番木瓜蛋白酶精酶純化工藝(專利號：92115284.1)，謝丹青等在申請的專利中介紹了一種菠蘿蛋白酶的提取方法(申請?zhí)枺?00610036906.4)，但目前尚沒有冬瓜蛋白酶方面的研究報道。已公開的這兩類蛋白酶的生產(chǎn)原料均產(chǎn)自熱帶，產(chǎn)地溫度高，使原料的儲存、運輸和酶制劑生產(chǎn)帶來許多不便。冬瓜是一種適應(yīng)范圍廣的蔬菜，且產(chǎn)量極高，冬瓜汁液中富含蛋白酶，以它為原料生產(chǎn)蛋白酶具有獨特的優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點，提供一種快速簡便的冬瓜蛋白酶的純化方法，整個純化過程僅包括硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sepharose?FF陰離子交換層析和Superdex?75凝膠過濾層析三個關(guān)鍵技術(shù)步驟，蛋白酶得率高，每公斤冬瓜可得40-50mg蛋白酶；所得蛋白酶的純度高，經(jīng)過SDS-PAGE檢測已達(dá)到電泳純；所得蛋白酶的熱穩(wěn)定性好，在80℃保溫100min，仍能有90％的活性；作用溫度范圍寬，在25℃～80℃范圍內(nèi)均顯示出良好的水解活性；發(fā)揮作用的pH范圍寬，在pH5.0～pH8.0的范圍內(nèi)，有良好的酶學(xué)活性。純化的冬瓜蛋白酶在食品加工、紡織品加工、醫(yī)療保健等方面具有良好的應(yīng)用前景。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明方法按照如下步驟操作：

第一步，冬瓜蛋白酶的提取：取冬瓜，去皮、打碎，將勻漿液過濾，濾液離心，取上清液；

第二步，硫酸銨分級沉淀及透析脫鹽：向上清液中邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨至30％飽和度，繼續(xù)攪拌，離心，沉淀溶解在TS緩沖溶液中，上清液繼續(xù)加入硫酸銨至50％飽和度，離心，沉淀溶解在TE緩沖溶液(20mmol/L?Tris-Cl，pH8.0，2mmol/L?EDTA)中，上清液繼續(xù)加入硫酸銨至80％飽和度，沉淀溶解在TE緩沖溶液(20mmol/LTris-Cl，pH8.0，2mmol/L?EDTA)中，將不同飽和度的硫酸銨沉淀出的蛋白質(zhì)用TS緩沖溶液溶解后，裝入透析袋中，4℃下，對TS緩沖溶液透析12小時；所用TS緩沖液為20mmol/L?Tris-Cl，pH8.0，2mmol/L?EDTA，50mmol/LNaCl，沉淀溶解液對TS緩沖液透析的體積比為1∶1000-1∶2000；

第三步，離子交換層析：將透析脫鹽的提取液上DEAE-Sepharose?FF陰離子交換柱，分別用含0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35，0.4mol/LNaCl的TS緩沖液進(jìn)行不連續(xù)梯度洗脫，每個梯度使用一個柱床體積，收集0.2mol/L?NaCl的洗脫液；

第四步，凝膠過濾層析：將0.2mol/L?NaCl的洗脫液濃縮后上Superdex?75凝膠過濾層析柱，上樣量與柱床體積比為1∶150-1∶200；洗脫液為TS緩沖液(20mmol/LTris-Cl，pH8.0，2mmol/L?EDTA，50mmol/L?NaCl)流速0.5-1mL/min，分步收集洗脫液，合并具有酪蛋白水解活性的洗脫液；將洗脫液冷凍干燥即得到分子量在65～67kD(千道爾頓)之間的純化冬瓜蛋白酶。

附圖說明：

圖1為凝膠過濾層析蛋白的SDS-PAGE分析圖譜。

圖2為純化冬瓜蛋白酶的酪蛋白水解活性測定圖。

圖3為溫度對冬瓜蛋白酶活性的影響曲線圖。

圖4為pH對冬瓜蛋白酶活性的影響曲線圖。

圖5為冬瓜蛋白酶的熱穩(wěn)定性曲線圖。

具體實施方式：

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實施例1：冬瓜蛋白酶的分離純化