[發明專利]一種冬瓜蛋白酶的純化方法

無效

• 申請號: 200710114209.0
• 申請日: 2007-11-12
• 公開（公告）號: CN101182504A
• 公開（公告）日: 2008-05-21
• 發明（設計）人: 惠靜璇
• 申請（專利權）人: 惠靜璇
• 主分類號: C12N9/50
• 分類號: C12N9/50
• 代理公司: 青島高曉專利事務所
• 代理人: 隋臻瑋;于正河

1.一種冬瓜蛋白酶的純化方法，其特征在于按照以下步驟操作：第一步，取冬瓜，去皮、打碎，將勻漿液過濾，濾液離心，取上清液；第二步，向上清液中邊攪拌邊加入硫酸銨至30％飽和度，繼續攪拌，離心，沉淀溶解在TS緩沖溶液中，上清液繼續加入硫酸銨至50％飽和度，離心，沉淀溶解在TE緩沖溶液中，上清液繼續加入硫酸銨至80％飽和度，沉淀溶解在TE緩沖溶液中，將不同飽和度的硫酸銨沉淀出的蛋白質用TS緩沖溶液溶解后，裝入透析袋中，4℃下，對TS緩沖溶液透析12小時；第三步，將透析脫鹽的提取液上DEAE-SepharoseFF陰離子交換柱，分別用含0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35，0.4mol/LNaCl的TS緩沖液進行不連續梯度洗脫，收集0.2mol/L?NaCl的洗脫液；第四步，將收集到的洗脫液濃縮后上Superdex?75凝膠過濾層析柱，上樣量與柱床體積比為1∶150～1∶200；洗脫液為TS緩沖液，流速0.5-1mL/min，分步收集洗脫液，合并具有酪蛋白水解活性的洗脫液；將洗脫液冷凍干燥即得到分子量在65～67kD的純化冬瓜蛋白酶。

2.根據權利要求1所述的一種冬瓜蛋白酶的純化方法，其特征在于第二、四步所用的TS緩沖液為20mmol/L?Tris-Cl，pH8.0，2mmol/L?EDTA，50mmol/LNaCl，沉淀溶解液對TS緩沖液透析的體積比為1∶1000～1∶2000。

3.根據權利要求1所述的一種冬瓜蛋白酶的純化方法，其特征在于第二步所用的TE緩沖液為20mmol/L?Tris-Cl，pH8.0，2mmol/L?EDTA。

4.根據權利要求1所述的一種冬瓜蛋白酶的純化方法，其特征在于第三步中將透析過的提取液上事先用TS緩沖溶液平衡好的DEAE-Sepharose?FF陰離子交換柱，用1倍柱床體積的TS緩沖溶液沖洗層析；每個梯度洗脫所用的TS緩沖液為一個柱床體積。