[發明專利]制備雞馬立克氏病毒感染檢測抗原的新原料及其篩選方法

無效

• 申請號: 200710113727.0
• 申請日: 2007-08-31
• 公開（公告）號: CN101377489A
• 公開（公告）日: 2009-03-04
• 發明（設計）人: 張訓海
• 申請（專利權）人: 張訓海
• 主分類號: G01N33/531
• 分類號: G01N33/531;G01N33/569;G01N33/561
• 代理公司: 蚌埠鼎力專利商標事務所有限公司
• 代理人: 倪波

技術領域：

本發明涉及禽病檢測試劑領域，尤其是雞馬立克氏病毒感染檢測抗原的新原料及其篩選方法。

背景技術：

馬立克氏病(MD)是世界上首例通過疫苗控制的倍受獸醫界、醫學界和生物界關注的致瘤性和免疫抑制性傳染病，其病原為馬立克氏皰疹病毒(MDV)。由于該病嚴重損害雞免疫系統，除本身可招致長達數月及累計高達70％以上的致死外，常導致各種“雞瘟”疫苗的免疫失敗或繼發感染而造成重大損失。鑒于MDV污染嚴重，毒力不斷增強，加之MD致瘤潛伏期長和隱蔽性極強，即使免疫后也不能阻斷其侵入與傳播，因此，MDV強毒污染監測不僅是MD防制的源頭，也是確保其它禽用疫苗免疫效果的前提和評價養禽生物安全狀況有效方法。

檢測雞群MDV強毒感染的方法有多種，如病毒的分離與鑒定、血清學檢查及MDV特異DNA的檢測等。MDV的分離與鑒定，雖有其特別的用途，但其分離的難度較大，易受污染的影響且費時，故不適于常規檢測和流行病學調查。MDV分子水平的特異性檢測，如核酸探針和聚合酶鏈反應(PCR)，雖然由于其特異性強、敏感性高等優點已成功地用于MDV的檢測，但其嚴格的物質技術條件限制和高昂的檢測費用，因而難以推廣和普及。

雞MDV強毒感染的血清學檢查，特別是瓊脂凝膠免疫擴散試驗即簡稱為瓊擴試驗，因特異、敏感、簡便、直觀和可重復性強及檢測費用相對低廉而廣泛應用(NY/T?905-2004)。其主要是用標準MDV陽性抗原和MDV陽性抗體，來檢測雞群體內有無明顯反應性的MDV抗體和/或MDV抗原，從而得出雞群是否有MDV強毒的感染或污染。目前，國內外制備的MDV陽性瓊擴抗原，主要是源于MDV強毒細胞培養后的感染細胞及其培養液，或是源于MDV強毒感染雞羽囊液及皮膚，或源于MDV抗原基因(gC、gB)的原核或真核表達產物。這種方法進行生產的主要缺點是需要有一定的生產工藝、流程和周期，即都需要有細胞生長的條件與MDV強毒增殖的過程，或含目的抗原基因的原核或真核表達條件與過程，從而才能在培養細胞中產生出MDV的病毒性抗原，并須對生產過程中的生物安全控制要求很嚴，進一步加大了生產成本。而標準MDV陽性抗原的生產成本，則是構成雞MDV強毒感染的血清學檢測成本的主要因素。

發明內容：

本發明的目的是根據MD疫苗能夠產生可與致病性MDV強毒抗原具有交叉反應性的主要可溶性分泌抗原，以該MD疫苗的培養廢棄液作為制備MDV檢測抗原的原料。

本發明的另一目的在于提供這種新原料的篩選方法。

MDV是細胞結合性病毒，其有三個血清型，從溫和型到毒力很強的致瘤株及其致弱株，均歸為血清1型MDV，天然不致瘤的病毒株為血清2型，異源的火雞皰疹病毒(HVT)則屬于血清3型。三個血清型中只有血清1型中的強毒株對雞是致瘤或致病性的，且三個血清型的非致病毒株都可用作MD的疫苗。由于MD疫苗的廣泛使用，不同血清型MD疫苗均有不同程度的商業化生產。鑒于三個血清型MDV之間存在很強的群特異性抗原，并且這種群特異性抗原是可溶性分泌抗原。因此，在其增殖或疫苗生產過程中，是能夠產生與MDV強毒抗原具有交叉反應性的病毒性抗原，如能從以上各種商業化生產的MD疫苗中，篩選出可替代MDV強毒的增殖來制備MDV陽性抗原的疫苗培養棄液，將是一種十分經濟、安全和有效制備MDV抗原的原料來源。

本發明采用馬立克氏病疫苗培養廢棄液作為制備雞馬立克氏病毒感染檢測抗原的原料。

本發明以MDV血清1型的CVI988/Rispens株及其低代次種毒進行疫苗毒的增殖培養，在收獲合格的感染細胞后，其病毒培養的上清液即培養后的廢棄液作為制備雞馬立克氏病毒感染檢測抗原的原料。

本發明以MDV血清3型的火雞皰疹病毒Fc-126株及其低代次種毒進行HVT疫苗的增殖培養，在收獲合格的感染細胞后，其培養上清廢棄液作為制備雞馬立克氏病毒感染檢測抗原的原料。

本發明以CVI988作為重組疫苗的載體，若其增殖培養液中分泌有一定含量的目的MDV抗原，其細胞培養上清廢棄液可作為制備雞馬立克氏病毒感染檢測抗原的原料。

本發明所提供的新原料的篩選方法是：應用免疫學檢測技術和/或蛋白質電泳分析技術對馬立克氏病疫苗株合格培養后的廢棄液進行檢測評價和篩選。

上述篩選方法中所述的免疫學檢測技術和/或蛋白質電泳分析技術是指采用瓊擴試驗、酶聯免疫試驗、SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳技術分析和/或結合固定化蛋白質的免疫學測定(Western印跡法)進行檢測評價與篩選。