[發明專利]KNSL4的轉移相關基因功能和預測乳腺癌患者預后的標志物用途及其應用方法

無效

• 申請號: 200710111637.8
• 申請日: 2007-06-01
• 公開（公告）號: CN101089198A
• 公開（公告）日: 2007-12-19
• 發明（設計）人: 馮玉梅;李曉青;萬艷芳
• 申請（專利權）人: 天津醫科大學附屬腫瘤醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 天津市宗欣專利商標代理有限公司
• 代理人: 董光仁

技術領域

本項目屬于已知基因的新功能、新用途和應用方法的發明。具體講是發現了已知基因KNSL4的轉移相關基因功能，并可作為乳腺癌患者預后預測的基因標志；發明了基于KNSL4基因mRNA表達量預測乳腺癌患者預后的方法。

技術背景

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，在歐美國家發病率高達10％，而低發的亞洲國家近年來發病人數和死亡人數呈顯著的上升趨勢，我國大城市中乳腺癌發病率已居女性惡性腫瘤的首位，成為婦女健康的重大威脅。乳腺癌是全身性疾病，腫瘤細胞的淋巴道和血道播散導致的全身轉移是乳腺癌患者治療失敗和死亡的關鍵所在。乳腺癌轉移相關基因的發現將為轉移機制的研究提供線索，為轉移的早期診斷提供分子標志，為患者的預后評估提供客觀指征，為抗轉移治療提供基因靶點。

目前，關于驅動蛋白樣DNA結合蛋白基因(kinesin-like?DNA?bindingprotein，KNSL4，kinesin-like?4，KIF22，Accession?No.NM_007317)及其蛋白產物Kid的研究報道都是關于分子結構和基于分子結構的生物學功能的研究，已知該基因編碼的Kid蛋白與微管結合驅動染色體的運動，在細胞有絲分裂中起關鍵作用。但KNSL4基因的改變對于細胞生物學行為的影響、與組織病理學改變的關系、基因表達量檢測方法和應用的研究還是空白。

發明內容

為了篩選乳腺癌轉移相關基因，采用Differential?display?RT-PCR(DDRT-PCR)方法，通過比較淋巴結轉移陽性乳腺癌患者的原發癌和配對的淋巴結轉移癌組織基因表達的差異和實時定量RT-PCR方法驗證，發現了KNSL4的轉移相關基因的新功能。

建立了定量RT-PCR檢測KNSL4?mRNA表達量的方法；經大樣本量的臨床病例檢測，發現KNSL4?mRNA水平與乳腺癌的多種臨床病理因素及轉移預后相關，與患者無轉移生存期呈負相關(P＜0.05)，因此，KNSL4mRNA可作為乳腺癌患者預后預測的分子標志物；確定了基于KNSL4mRNA表達量可以區分預后好和預后差的患者群的臨界值，高于臨界值的患者判斷判斷為預后好，低于臨界值的患者為預后差。

主要發明如下：

驅動蛋白樣DNA結合蛋白(kinesin-like?DNA?binding?protein，Kid，KIF22，Accession?No.NP_015556)基因(kinesin-like?4，KNSL4，AccessionNo.NM_007317)的轉移相關基因功能。

KNSL4基因表達水平預測乳腺癌患者預后的標志物用途，基于KNSL4基因表達水平可以預測乳腺癌患者的預后，KNSL4表達水平高的患者預后好，表達水平低的患者預后差。

基于KNSL4基因表達水平預測乳腺癌患者預后的檢測及應用方法，

a.提取腫瘤患者原發癌組織標本的細胞總RNA；以RNA為模板逆轉錄合成cDNA；以cDNA為模板，用KNSL4基因和管家基因的特異性引物和熒光標記探針進行實時定量PCR擴增，計算KNSL4基因mRNA的相對表達量為2^-ΔCt，其中，ΔCt＝Ct_KNSL4-Ct_GAPDH(C_T為實時定量PCR時熒光信號達到設定閾值時所經過的循環數)；

b.根據乳腺癌患者復發轉移陽性病例和復發轉移陰性病例的KNSL4?mRNA表達量，確定預后判斷的臨界值。KNSL4?mRNA表達量高于臨界值的患者預后好，而低于臨界值的患者預后差。

所述的檢測方法，以原發癌組織中KNSL4?mRNA表達量為1.40×10^-3作為對腫瘤患者預后判斷的臨界值，高于該臨界值的患者則判斷為預后好，低于該臨界值則判斷為預后差。

所述的檢測方法，

KNSL4基因實時定量RT-PCR的引物和探針序列是：上游引物5’-CAAGGAGGGAGTGGAATG-3’；下游引物5’-GGAGGTGGACGACGAGTAG-3’；特異性熒光標記探針序列：5’(FAM)-GCGGCGATCTCAGGAGCTGGTCGCT-3’(TAMRA)。

所述的檢測方法，其熒光報告基團還可以是SYBR?Green?I、VIC、TETJOE、NED、TAMRA、Cy3、Cy5、ROX、Texas?Red等熒光染料。

附圖說明

附圖是KNSL4?mRNA表達與患者生存期分析圖。

具體實施方式

一、病例資料及標本取材

1.病例資料