[發明專利]檢測鼻咽癌特征蛋白的優化質譜模型及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 200710111286.0
• 申請日: 2007-06-21
• 公開（公告）號: CN101329350A
• 公開（公告）日: 2008-12-24
• 發明（設計）人: 曾益新;許洋
• 申請（專利權）人: 許洋
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/574;G01N30/02
• 代理公司: 暫無信息
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技術領域

本發明屬于質譜檢測技術領域，特別涉及對鼻咽癌血液優化的質譜檢測方法。一種通 過能與蛋白質結合的磁珠基質去捕獲生物標志，并用有定量控制的質譜分析來檢測鼻咽癌 生物標志。在此提及的此項發明涉及蛋白質檢測領域，為一種新的非侵入性的體外質譜 檢測方法。本發明可以應用到已經脫離人體的體液中的鼻咽癌生物標志組合的檢測方法或 試劑盒。

背景技術

鼻咽癌的發生是一個多基因突變導致抑癌基因失活、癌基因活化的過程。腫瘤的發生、 發展是一個十分復雜和漫長的過程，伴隨多基因和蛋白的分子改變。基因組學研究由于自 身的限制難以完全闡明基因與蛋白質參與過程及其具體作用。蛋白質組學高靈敏度的分析 技術有助于捕獲那些在腫瘤演變過程中細微的分子變化，使之成為診斷和監測腫瘤演變的 重要線索。目前臨床上對惡性腫瘤預后評估主要依賴于臨床表現、病理學及傳統腫瘤標志 (tumor?marker)，但腫瘤早期復發或轉移時常常無明顯臨床表現，而病理學證據很難得 到且重復性差。鼻咽癌的發病率以中國的南方較高，如廣東、廣西、湖南等省，特別是廣 東的中部和西部的肇慶、佛山和廣州地區更高。據報道，居住在廣東省中部以及操廣東地 方語的男性，其發病率為30/10萬～50/10萬。就全國而言，鼻咽癌的發病率由南到北 逐漸降低，如最北方的發病率不高于2/10萬～3/10萬。鼻咽癌容易發生頸部淋巴結轉 移，約為60％～86％，鼻咽癌的遠處轉移率約在5％～27％之間。遠處轉移是鼻咽癌治療 失敗的主要原因之一。常見的轉移部位是骨、肺、肝等，多器官同時轉移多見。EB病毒 血清學檢測目前普遍應用的是以免疫酶法檢測EB病毒的IgA/VCA和IgA/EA抗體滴度。 前者敏感度較高，準確性較低；而后者恰與之相反。故對疑及鼻咽癌者宜同時進行兩種抗 體的檢測，這對早期診斷有一定幫助。近年來隨著臨床蛋白質組學的開展，使得鼻咽癌的 早期發現成為可能。

蛋白質的分離技術在蛋白質組學中應用分離技術有兩個目的。第一、通過將蛋白質的 混合物分離成單一蛋白質或蛋白質小組以簡化復雜的蛋白質混合物；第二、通過標記的方 法可以比較兩個蛋白質的混合物樣品中蛋白質的不同表現。其中主要的技術有雙向電泳 (two-dimensional?gel?electrophoresis，2-DE)、高效液相層析(high-performance liquid?chromatography，HPLC)、毛細管電泳(capillary?electrophoresis，CE)、親和 層析(affinity?choromatography)、蛋白芯片(protein?microarray)、磁性微球(magnetic beads，簡稱磁珠)和免疫組等。特別是蛋白芯片和磁珠兩項新的蛋白指紋圖譜技術克服 了以往技術的缺點，具有高靈敏度、高通量、結果重復性好、可機械化操作和方法靈活等 特點。待測樣品來源廣泛，不需作特殊前處理，可以直接點樣檢測，如血清、尿液及組織 液等；檢測快速，一般一例標本的檢測時間僅需約5分鐘，從標本制備到出結果全過程僅 約1小時。蛋白芯片和磁珠兩項新的蛋白指紋圖譜技術有可能在體液中潛在生物標志 (biomarker)檢測方面創造革命性突破(許洋，蛋白質指紋圖譜技術在實驗診斷與臨床 醫學中的研究進展，基礎醫學與臨床，2007，27：134-142)。基質輔助激光解析/電離飛行 時間質譜(matrix-assisted?laser?desorption/ionization?time?of?fight?mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)與蛋白芯片分離技術聯合應用即為表面增強激光解析/電 離飛行時間質譜(surface?enhanced?laser?desorption/ionization?time?of?fight?mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)。2-DE最先被用于臨床蛋白組學研究，但其對疏水性、強 酸性和強鹼性蛋白的分辯率不夠，而且不能檢測低豐度蛋白，故實用價值受限。近來，蛋 白芯片與質譜技術(SELDI-TOF-MS)的結合，已被成功地用于腫瘤研究；但由于磁珠表面 的結合面積遠遠大于蛋白芯片，從而磁珠的靈敏性比蛋白芯片更高(劉建棟等，血液蛋白 質組與質譜儀檢測流程標準化初探。基礎醫學與臨床，2007，27：193-197)。磁珠具有優于 二維電泳、蛋白芯片和其他質譜方法的特點，已被廣泛地用于腫瘤生物標志的篩查等研究 (屠世良等，癌胚抗原陰性結直腸癌的檢測和結直腸癌預后相關生物標志，基礎醫學與臨 床，2007)。該技術具有操作簡便、無需離心樣品、可直接分析原始生物樣本(如血清、 尿液等)、樣本用量小等特點，同時適合多樣品平行檢測和直接進行蛋白質全景式的搜索 和分析，特別是對小分子量蛋白和低豐度蛋白具有較高的捕獲效果，可以與其他蛋白質組 學方法互補，目前已被廣泛地用于腫瘤標志的篩查和臨床檢測，并均已獲得很好的結果。 但國內迄今尚無采用磁珠與質譜技術獲得檢測正常及鼻咽癌血清特征蛋白的報道。