[發明專利]牛分枝桿菌Mce4E蛋白、其制備方法及應用

無效

• 申請號: 200710110627.2
• 申請日: 2007-06-07
• 公開（公告）號: CN101157722A
• 公開（公告）日: 2008-04-09
• 發明（設計）人: 趙德明;徐廣賢;周向梅;楊建民;尹曉敏;馬李穎
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C07K14/35
• 分類號: C07K14/35;C12N1/21;C12N15/31;G01N33/569
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司
• 代理人: 張慶敏

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及牛分枝桿菌Mce4E蛋白、其體外制備方法及應用。

背景技術

牛結核病主要是由牛分枝桿菌引起的一種慢性、消耗性人獸共患傳染病。目前全國有活動性肺結核患者約450萬人，每年新發活動性肺結核患者約145萬人，每年約有13萬人死于結核病，其中15％左右的人是感染牛分枝桿菌引起的。我國牛結核病的發病率呈現上升趨勢，一些省區已達到10％的陽性率；目前發現很多野生動物(如獾、水牛、獅子、羚羊、白尾鹿等)都能感染牛分枝桿菌，這對控制和根除牛結核構成嚴重的威脅。

當前，我國對牛結核的控制措施主要是淘汰結核陽性牛，因此，對牛結核進行準確的診斷就顯得尤為重要。傳統的單一結核菌素試驗的敏感性和特異性比較低，在臨床上會造成誤診，從而會直接危害人類生命健康，同時給生產帶來經濟損失，并且這種方法費時、費力、而且不易操作。

分枝桿菌哺乳動物細胞侵入蛋白(Mammalian?cell-entryproteins，Mce)家族蛋白質能使分枝桿菌侵入哺乳動物細胞，主要與分枝桿菌進入宿主細胞和在其內部存活有關。分枝桿菌中有4個mce操縱子(mce1、mce2、mce3、mce4)，每個操縱子編碼6個蛋白，在牛分枝桿菌中沒有mce3操縱子。結核分枝桿菌mce1?A蛋白能夠使無致病性的大腸桿菌進入非吞噬細胞，用該蛋白包被的微磁珠能夠進入非吞噬性的HeLa細胞，并使HeLa細胞的細胞膜骨架發生重排。Ahmad等研究表明，重組的Mce3E蛋白能夠與93％的結核病人血清發生反應，可以用來診斷自然感染結核病病人。

目前，國內外尚未見到有關牛分枝桿菌Mce4E蛋白的研究及應用的報道。

發明內容

本發明的目的在于提供牛分枝桿菌Mce4E蛋白；

本發明的另一個目的在于提供牛分枝桿菌Mce4E蛋白體外制備的方法；

本發明的再一個目的在于提供用于制備Mce4E的基因工程菌。

本發明所述的Mce4E蛋白具有序列表SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列，或者是該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。該蛋白的分子大小為45KDa，等電點為4.65，在第345個氨基酸處具有一個糖基化位點，通過圓二色譜(CD譜)測定表明其為典型的α螺旋型結構，經Yang-Chen氏公式計算，α螺旋含量為39.1％，β-折疊含量為0％，無規卷曲含量為60.9％，轉角含量為0％。

本發明利用mce4E(其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示)基因構建表達載體，轉化宿主菌，經過篩選得到轉化子PET30/Mce4E；轉化體經發酵培養后，破碎菌體，分離純化Mce4E，經復性，得到活性蛋白Mce4E。

具體地說本發明包括如下步驟：

1、基因工程菌的構建

根據mce4E基因(其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示，該序列即是成熟蛋白的編碼區段)設計合成擴增其成熟蛋白的PCR引物(末端分別帶有Sac?I和Kpn?I的酶切位點)，以牛分枝桿菌染色體DNA為模板，進行PCR擴增；擴增產物經瓊脂糖電泳，回收1000bp左右DNA片段，與pGEM-T?easy載體連接，轉化DH5α感受態細胞；純化重組質粒，用EcoR?I酶切鑒定，并測序，測序正確的陽性質粒經SacI/Kpn?I雙酶切后，與用經過Sac?I/Kpn?I雙酶切的pET?30a(+)連接后，轉化到BL21(DE3)菌株，用上述引物做菌落PCR，篩選陽性克隆，得到含有表達載體的宿主菌(轉化子)。

2、重組蛋白的表達及純化

將含有表達載體的宿主菌接種到LB液體培養基，經擴大培養，加入IPTG誘導表達，取出菌液離心，菌體用裂解緩沖液重懸，在冰浴條件下超聲破碎，離心，沉淀即為包涵體，可以將上清和沉淀用SDS-PAGE電泳檢測其分離是否成功。將獲得的包涵體蛋白用低濃度變性劑和/或溫和去垢劑TritonX-100洗滌，然后用變性緩沖液溶解，離心，取上清，將上清加入經pH7.8的8mol/L變性緩沖液平衡的Ni-NTA瓊脂糖柱，4℃條件下，結合30min，然后依次用10～20倍柱床體積的pH7.8～5.0梯度緩沖液由大到小洗滌Ni-NTA柱，洗去雜蛋白，最后用pH4.0洗脫緩沖液洗脫含有His-tag的重組蛋白，分管收集，洗脫流速控制在5～7mL/h。

3、復性