[發明專利]修飾的核酸序列以及增加細胞系統中mRNA水平和蛋白質表達的方法

無效

• 申請號: 200710104933.5
• 申請日: 1998-10-20
• 公開（公告）號: CN101134966A
• 公開（公告）日: 2008-03-05
• 發明（設計）人: L·H·陳;H·米德
• 申請（專利權）人: GTC生物治療學公司
• 主分類號: C12N15/30
• 分類號: C12N15/30;C12N15/67;C12N5/10;C12N1/21;C07K14/445;A61K48/00
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 胡國群

本申請是申請日為1998年10月20日、申請號為98810400.8、發明名稱為“修飾的核酸序列以及增加細胞系統中mRNA水平和蛋白質表達的方法”的發明專利申請的分案申請。

本發明的背景

發明領域

本發明涉及異源基因表達。更具體地，本發明涉及在較高等的真核細胞系統中表達微生物或寄生生物的基因。

相關的現有技術綜述

在體外細胞培養系統或體內重組生產系統中進行某種異源基因產物的重組生產通常是困難的。例如，許多研究人員發現，在與蛋白質原始來源的細胞不同的細胞培養系統，特別是哺乳動物細胞培養系統中難以表達來自細菌、寄生生物和病毒的蛋白質。難以由哺乳動物細胞產生的醫療上重要蛋白質的一個例子是瘧原蟲裂殖子表面蛋白(malaria?merozoite?surface?protein)(MSP-1)。

瘧疾在熱帶國家是嚴重的健康問題。對現存藥物的抗性迅速發展，因而急需疫苗。在惡性瘧原蟲(P.falciparum)生長周期中表達的多種抗原中，MSP-1是研究最深入的并且看來是最成功的接種候選物。暴露于惡性瘧原蟲的個體產生抗MSP-1抗體，研究表明在對MSP-1的天然獲得性免疫反應和減低的瘧疾發病率之間有相關性。在一系列研究中，用純化的天然MSP-1或該蛋白的重組片段免疫可以誘導至少部分對該寄生生物的防護(Diggs等，(1993)Parasitol?Today9：300-302)。因此MSP-1是開發抗惡性瘧原蟲疫苗的重要靶。

MSP-1是一種190-220kDA的糖蛋白。C-末端區域已經是可用作疫苗的重組產物的焦點。然而，開發MSP-1用作疫苗的一個主要問題是在細菌或酵母表達系統難以獲得與親和純化的天然蛋白質具有同等免疫學能力的重組蛋白(Chang等，(1992)免疫學雜志(J.Immunol.)148：548-555)以及使疫苗生產可行的足夠量的重組蛋白。

改進的方法是有利的，它能夠增強以前難以重組表達的來自寄生生物、細菌和病毒的蛋白質的足夠量的表達。特別是，一種能夠表達足夠量MSP-1的重組系統是特別有利的。

本發明的概述

本發明提供了改進的重組DNA成分和增加蛋白質的mRNA水平和蛋白質表達的方法，這里的蛋白質是來自異源細胞的，優選是諸如細菌、病毒和寄生生物等低等生物的，且以前在細胞培養系統、哺乳動物細胞培養系統或轉基因動物中難以表達的蛋白質。適于依據本發明的表達系統表達的優選蛋白候選物是那些具有相對重組表達系統而言含高總AT量或富AT區域和/或mRNA不穩定基序和/或稀有密碼子的DNA編碼序列的蛋白質。

第一個方面，本發明特征是一種修飾的已知核酸，優選的是能在一種系統中表達的來自細菌、病毒或寄生生物的一個基因，其中的修飾包括相對未修飾序列有降低的AT含量，并且可任選的進一步包括消除至少一種或全部在天然基因中存在的mRNA不穩定基序。在特定優選實施方案中，修飾進一步包括用細胞系統的優選密碼子置換天然基因的一個或多個密碼子。

第二個方面，本發明提供了制備本發明的修飾的核酸的方法，包括降低編碼蛋白質的天然基因的總AT含量和/或消除mRNA不穩定基序中的至少一個或全部和/或使用選擇的細胞系統的優選密碼子置換一個或多個密碼子(均采用選擇的細胞系統識別的、優選地為選擇的細胞系優選的并且編碼與所置換的密碼子相同的氨基酸的密碼子來置換天然基因中的一個或多個密碼子)。本發明的這一方面進一步包括依據本發明方法制備的修飾的核酸。

第三個方面，本發明亦提供了含有本發明核酸和在選擇的細胞系或生物體中有活性的啟動子的載體，以及用本發明核酸轉化的宿主細胞。

第四個方面，本發明提供了，用于生產轉基因泌乳動物(lactat?inganimal)的含有本發明核酸的轉基因表達載體以及其種系含有本發明核酸的轉基因非人泌乳動物。

第五個方面，本發明提供了用于生產轉基因的泌乳動物物種的轉基因表達載體，包括本發明核酸和操作地偶聯到該核酸上的指導乳腺將該核酸編碼的蛋白質表達到轉基因動物乳汁中的啟動子。

第六個方面，本發明提供了含有依據本發明的修飾的核酸的DNA疫苗。本發明這一方面的一個優選實施方案包括依據本發明的修飾的MSP-1基因的片段。

附圖的說明