[發明專利]一種測定核糖核酸活性的方法

無效

• 申請號: 200710099980.5
• 申請日: 2007-06-01
• 公開（公告）號: CN101063175A
• 公開（公告）日: 2007-10-31
• 發明（設計）人: 孫德軍;霍英;李夏;李秉安;禹學軍
• 申請（專利權）人: 吉林敖東藥業集團延吉股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種測定核糖核酸活性的方法。

背景技術

核糖核酸是動物體內一種生物大分子，是一種重要的免疫觸發劑或免疫調節劑。近年來，核糖核酸的研究日益深入，核糖核酸已廣泛應用于臨床并取得了一定的療效。為了進一步提高療效專一性，人們又研制出具有組織特異性的免疫核糖核酸，具有特異免疫活性。1967年通過肉瘤免疫綿羊制取的淋巴細胞核糖核酸對大鼠進行試驗，發現核糖核酸能抑制荷瘤鼠腫瘤的生長，甚至消除，首次證實了免疫核糖核酸能傳遞免疫信息。1982年林單坤等人把從免疫羊肝中提取得到的核糖核酸做成制劑注入體內，發現對腫瘤與癌癥有明顯的療效并能提高機體的免疫功能，而且未出現不良的副作用。從脾臟中提取得到的免疫核糖核直接制成針注入體內，可激活人體的T細胞及B細胞的活性；同時有提高人體免疫功能的作用，對一些與人體免疫功能下降有關的疾病，如慢性支氣管炎、哮喘病、慢性乙型肝炎等，以及胃癌、乳腺癌、大腸癌等惡性腫瘤有顯著的療效。但目前還沒有可行的核糖核酸活性測定方法來保證核糖核酸的活性和臨床藥效。

發明內容

本發明的目的是提供一種測定核糖核酸活性的方法。

本發明測定核糖核酸活性的方法，是將核糖核酸用培養液制成每1ml中含核糖核酸0.01～50mg的溶液，作為供試品溶液，以培養液作為對照組溶液，測定供試品溶液和對照組溶液的粘附前細胞的吸收值和粘附后細胞的吸收值，然后，按照如下公式計算粘附率和粘附抑制率：

粘附率＝(粘附前細胞的吸收值-粘附后細胞的吸收值)/粘附前細胞吸收值×100％；

粘附抑制率＝(對照組粘附率-供試品粘附率)/對照組粘附率×100％；

其中，粘附前細胞的吸收值和粘附后細胞的吸收值的測定按如下過程進行：

1)測定粘附前細胞的吸收值

取測試溶液50μl，加小鼠脾細胞懸液50μl混勻，再加50μl培養液，在360～550nm波長處測定吸收值，作為粘附前細胞的吸收值；

2)測定粘附后細胞的吸收值

取測試溶液50μl，加小鼠脾細胞懸液50μl；將培養板于二氧化碳培養箱中，37℃孵化0.5～2小時，使細胞在培養板底部粘附；取出細胞培養板，振蕩15～120秒，將未粘附細胞搖起，吸出上清液；再加入培養液液50μl洗一次，將洗液與上清液合并，在360～550nm波長下測定吸收值，作為粘附后細胞的吸收值。

其中，測定吸收值的波長優選為405nm；培養液為含10％小牛血清的RPMI-1640培養液，用Hepes和碳酸氫鈉調節pH值至7.2～7.4。

按如下過程制備小鼠脾細胞懸液：

將小鼠拉脫頸椎或放血而死，用碘酒、酒精處理皮毛，剪開皮膚，打開腹腔。在胃底部找到紅色的脾，用鑷子分離后摘除；脾經培養液洗滌后，置50～300目不銹鋼網上，用剪刀剪成數塊，用注射器柄擠壓研磨，1000r/min離心，懸起沉淀部分即得小鼠脾細胞懸液。

本發明采用白細胞粘附抑制試驗來測定核糖核酸活性，測定方法要求低，儀器設備簡單，操作簡便、安全、易于掌握，而且可以使細胞與接觸面充分接觸黏附，未黏附細胞也便于洗去，測定結果穩定、重復性較好。

具體實施方式

實施例1、制備核糖核酸

一、配制溶液

(1)提取緩沖液(0.02M?Tris-乙酸緩沖液)

900ml純化水，加2.42克Tris，用乙酸調pH5.0，定容至1000ml。

(2)飽和酚液體

將苯酚在50℃融化，加入等體積提取緩沖液，攪拌均勻制成飽和酚溶液，避光保存。

(3)助沉淀緩沖液

3M乙酸鈉溶液，pH5.0

(4)溶解緩沖液

1M?NaCl溶于0.05M?Tris-HCl緩沖液中，pH9.5。

二、提取過程

1、原材料選擇和預處理

取小牛(1歲半以下)胰腺50公斤在25℃左右去筋膜、脂肪及結締組織等非胰腺組織，用純化水清洗干凈，切成3～5cm小塊。

2、組織及細胞的破碎

用干凈絞肉機將胰腺小塊絞碎，將絞碎的小牛胰腺移入膠體磨中，加入等量提取緩沖液，第一次以200μm破碎研磨，第二次以50μ研磨，真空下，研磨液應較易通過200目不銹鋼網，得到100kg左右的勻漿液。

3、有效成份提取