[發明專利]檢測DNA甲基化程度的方法和試劑盒

有效

• 申請號: 200710096976.3
• 申請日: 2007-04-23
• 公開（公告）號: CN101153336A
• 公開（公告）日: 2008-04-02
• 發明（設計）人: 盧煜明;陳君賜;丁春明
• 申請（專利權）人: 香港中文大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N33/96;G01N33/48
• 代理公司: 北京英賽嘉華知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 王達佐;王俊

技術領域

本發明涉及檢測DNA序列甲基化程度的方法，以及利用DNA序列的甲基化程度來檢測、預后或監測個體中癌癥的試劑盒。

發明背景

已熟知腫瘤抑制基因在腫瘤細胞中被甲基化。因而，甲基化標志物已被建議用于檢測或監測患者癌癥。已有多種方法被提議用于檢測這些甲基化的序列。

甲基化特異PCR(MSP)是檢測甲基化或未甲基化的DNA最常用的方法。MSP涉及亞硫酸氫鹽轉化的步驟。用亞硫酸氫鈉使胞嘧啶脫氨基成為尿嘧啶，而5-甲基胞嘧啶保持完好。甲基化特異PCR使用靶向亞硫酸氫鹽誘導的序列改變的PCR引物，以特異性擴增甲基化的或未甲基化的等位基因。亞硫酸氫鹽轉化破壞約95％的DNA。由于血清或血漿中DNA的濃度通常很低，DNA減少95％導致檢出率小于50％。

其它方法使用特異消化甲基化或未甲基化DNA的限制性內切酶。特異消化甲基化DNA的酶很少。但是，特異消化未甲基化DNA的酶很容易得到。檢測方法然后確立消化是否發生，并且因此允許檢測所關注DNA是否甲基化或未甲基化(這取決于所用酶的特異性)，其與癌癥相關或不相關。

以前已提出過甲基化敏感的酶消化。例如，Silva?et?al，BritishJournal?of?Cancer，80：1262-1264，1999進行了甲基化敏感的酶消化及之后的PCR。但是，如作者Yegnasubramanian?et?al，Nucleic?AcidsResearch，Vol.34，No.3，2006e?19所指出的，這些方法被產生的假陽性數所困擾。

本發明尋求提供甲基化敏感的檢測的更好方法，其排除或減少假陽性和/或假陰性。

發明內容

根據本發明的第一方面，提供了檢測或監測包含至少兩個甲基化敏感限制酶識別位點的靶DNA序列的甲基化程度的方法，所述方法包括：

(a)以識別所述甲基化敏感限制酶識別位點的一種或多種甲基化敏感限制酶消化含有所述靶DNA序列的樣品；以及

(b)定量消化后所述樣品中殘留的所述靶DNA序列，

其中步驟(b)中得到的所述靶DNA序列的水平表明所述甲基化程度。

本發明的方法利用甲基化敏感限制酶在多個位點切割靶DNA序列，大大提高了檢測的準確性。

相應地，本發明還提供了使用選自來自個體的血液、血漿、血清、唾液、尿的生物樣品檢測或監測癌癥的方法，所述方法包括：

(a)從所述生物樣品獲得DNA；

(b)使用一種或多種甲基化敏感限制酶消化該DNA樣品；

(c)在步驟(b)之后量化或檢測靶DNA序列，其中靶DNA序列含有至少兩個甲基化敏感限制酶的識別位點；以及

(d)將來自該個體的該DNA序列的水平與正常標準比較，以檢測、預測或監測癌癥。

在本發明的優選實施方案中，將聚合酶鏈式反應(PCR)或實時定量聚合酶鏈式反應(Q-PCR)用于定量靶DNA序列。優選地，該甲基化敏感限制酶識別未甲基化的DNA序列。該靶序列為癌癥患者的易被甲基化的序列，因此正常患者的未甲基化的靶序列被消化，不被聚合酶鏈式反應擴增，而在癌癥患者中，靶序列被甲基化并且不被酶消化，隨后可被例如使用聚合酶鏈式反應量化或檢測。

本發明的方法可用于預測個體的癌癥易感性、評估個體中癌癥的階段、預測個體整體存活的可能性、預測個體的復發的可能性或評估個體中治療的有效性。

根據本發明的第二方面，提供了檢測、預后或監測個體中癌癥的試劑盒，包括

(i)至少一種甲基化敏感限制酶；以及

(ii)定量來自所述個體的樣品中靶DNA序列的單元，

其中所述靶DNA序列在癌癥中表現出異常甲基化模式，并且含有所述甲基化敏感限制酶能識別的至少兩個甲基化敏感限制酶識別位點。

在所述癌癥為肝細胞癌的本發明優選實施方案中，所述試劑盒優選還包括在樣品中定量甲胎蛋白的單元。在所述癌癥為鼻咽癌的本發明優選實施方案中，所述試劑盒優選還包括在樣品中定量EBV?DNA的單元。

附圖簡要說明

圖1顯示患者血漿中甲基化的RASSF1A的濃度。

圖2顯示手術切除肝細胞癌(HCC)后血漿甲基化RASSF1A水平的改變。

圖3顯示HCC患者中AFP和甲基化的RASSF1A序列的循環濃度之間沒有相關性。

圖4顯示HBV攜帶者中AFP和甲基化的RASSF1A序列的循環濃度之間沒有相關性。

圖5顯示血漿甲基化RASSF1A的定量分析可以補充用于HCC檢測的AFP分析。