[發明專利]檢測DNA甲基化程度的方法和試劑盒

有效

• 申請號: 200710096976.3
• 申請日: 2007-04-23
• 公開（公告）號: CN101153336A
• 公開（公告）日: 2008-04-02
• 發明（設計）人: 盧煜明;陳君賜;丁春明
• 申請（專利權）人: 香港中文大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N33/96;G01N33/48
• 代理公司: 北京英賽嘉華知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 王達佐;王俊

1.檢測或監測包含至少兩個甲基化敏感限制酶識別位點的靶DNA序列的甲基化程度的方法，所述方法包括：

(a)以識別所述甲基化敏感限制酶識別位點的一種或多種甲基化敏感限制酶消化含有所述靶DNA序列的樣品；以及

(b)定量消化后所述樣品中殘留的所述靶DNA序列，

其中步驟(b)中得到的所述靶DNA序列的水平表明所述甲基化程度。

2.如權利要求1所述的方法，其中在步驟(b)中采用聚合酶鏈式反應，且所述聚合酶鏈式反應的擴增子包含所述至少兩個甲基化敏感限制酶識別位點。

3.如權利要求1所述的方法，其中在步驟(b)中采用實時定量聚合酶鏈式反應，且所述實時定量聚合酶鏈式反應的擴增子包含所述至少兩個甲基化敏感限制酶識別位點。

4.如權利要求1、2或3所述的方法，其中所述靶DNA序列包含RASSF1A、其它腫瘤抑制基因或其它在癌癥中表現出異常甲基化模式的基因的至少一部分。

5.如權利要求4所述的方法，其中所述靶DNA序列選自RASSF1A的啟動子、外顯子1或其片段。

6.如權利要求5所述的方法，其中所述甲基化敏感限制酶為BstUI。

7.如權利要求1所述的方法，其中當所述靶DNA序列以未甲基化狀態存在時，消化后所述樣品中的所述靶DNA序列在至少一個甲基化敏感限制酶識別位點處被所述甲基化敏感限制酶所切割。

8.如權利要求1所述的方法，其中在步驟(a)中，所述樣品被過量的所述甲基化敏感限制酶處理，和/或延長孵育時間。

9.如權利要求1、2或3所述的方法，其中所述方法還包括定量所述樣品中的對照DNA序列以評估酶消化的程度或證實酶消化的完全，所述對照DNA序列不在癌癥中表現出異常的甲基化模式。

10.如權利要求9所述的方法，其中所述靶DNA序列中的所述至少兩個甲基化敏感限制酶識別位點存在于所述對照DNA序列中。

11.如權利要求10所述的方法，其中相同數量的甲基化敏感限制酶識別位點存在于所述對照DNA序列和所述靶DNA序列中。

12.如權利要求9所述的方法，其中所述對照DNA序列包括β肌動蛋白基因序列的至少一部分。

13.如權利要求1所述的方法，其中所述樣品為血液、血漿、血清、唾液或尿。

14.檢測、預后或監測個體癌癥的試劑盒，包括

(i)至少一種甲基化敏感限制酶；以及

(ii)定量來自所述個體的樣品中靶DNA序列的單元，其中所述靶DNA序列在癌癥中表現出異常甲基化模式，并且含有所述甲基化敏感限制酶能識別的至少兩個甲基化敏感限制酶識別位點。

15.如權利要求14所述的試劑盒，其中定量所述靶DNA序列的所述單元包括用于聚合酶鏈式反應的試劑，所述聚合酶鏈式反應的擴增子包含所述至少兩個甲基化限制酶識別位點。

16.如權利要求14所述的試劑盒，其中定量所述靶DNA序列的所述單元包括用于實時定量聚合酶鏈式反應的試劑，所述實時定量聚合酶鏈式反應的擴增子包含所述至少兩個甲基化限制酶識別位點。

17.如權利要求14、15或16所述的試劑盒，其中所述靶DNA序列包含RASSF1A、其它腫瘤抑制基因或其它在癌癥中證實具有異常甲基化模式的基因的至少一部分。

18.如權利要求17所述的試劑盒，其中所述靶DNA序列選自RASSF1A的啟動子、外顯子1或其片段。

19.如權利要求18所述的試劑盒，其中所述甲基化敏感限制酶為BstUI。

20.如權利要求17所述的試劑盒，其中所述試劑盒還包括用于定量所述樣品中甲胎蛋白的單元。

21.如權利要求17所述的試劑盒，其中所述試劑盒還包括用于定量所述樣品中EBV?DNA的單元。

22.如權利要求14、15或16所述的試劑盒，其中所述試劑盒還包括用于定量對照DNA序列的單元，所述對照DNA單元不在所述癌癥中表現出異常甲基化模式。