[發(fā)明專利]抗綠膿桿菌Fab’片段

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710093130.4
• 申請日: 2007-12-13
• 公開（公告）號(hào): CN101186648A
• 公開（公告）日: 2008-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張雅萍;莊穎;馬思遠(yuǎn)
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院
• 主分類號(hào): C07K16/04
• 分類號(hào): C07K16/04;A61K39/40;A61P31/04
• 代理公司: 北京瑞盟知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 孫民興;顧小曼

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種免疫球蛋白，具體涉及一種免疫球蛋白的Fab’片段。

背景技術(shù)

綠膿桿菌是假單胞菌屬中最為多見的一種條件致病菌，廣泛分布于自然界中，可通過環(huán)境污染、交叉感染、內(nèi)源性感染和醫(yī)源性感染等途徑傳播。綠膿桿菌對(duì)外界抵抗力較其他細(xì)菌強(qiáng)，在潮濕處能長期生存，對(duì)干燥抵抗力強(qiáng)，營養(yǎng)要求低，因其多重耐藥性等特征，目前已成為醫(yī)院內(nèi)感染的主要致病菌。綠膿桿菌感染與燒傷、免疫功能低下、敗血癥、下呼吸道感染等的關(guān)系極為密切，病死率極高。雖然針對(duì)綠膿桿菌感染采用的抗生素不斷更新，但由于綠膿桿菌具有廣譜耐藥性，治療效果往往不佳，使得尋找抗生素替代療法成為迫切需要。

Fab’片段具有成本低、產(chǎn)量高、易制備、均一性及穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)療效可靠、價(jià)格適宜。目前已成功提取出抗小分子蛋白質(zhì)、抗病毒的Fab’，并發(fā)現(xiàn)其具有良好的生物學(xué)效應(yīng)，用于口服防治腸道病原體已取得良好效果。隨著細(xì)菌耐藥現(xiàn)象的逐漸加重，尋求一種既能抗菌又能夠規(guī)避細(xì)菌耐藥的新型抗菌治療途徑已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種抗綠膿桿菌的Fab’片段。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案是：

抗綠膿桿菌Fab’片段，其特征在于：(1)所述抗綠膿桿菌Fab’片段能特異性結(jié)合綠膿桿菌；(2)所述抗綠膿桿菌Fab’片段是通過以下方法獲得的：用綠膿桿菌作為抗原免疫產(chǎn)蛋雞后收集所產(chǎn)的蛋，然后從其卵黃中分離水溶部分，并用硫酸鈉沉淀，取沉淀物，最后用胃蛋白酶水解沉淀物，收集分子量為44KDa的水解產(chǎn)物。

本發(fā)明所述的抗綠膿桿菌Fab’片段是從用綠膿桿菌作為抗原免疫的產(chǎn)蛋雞的雞蛋中提取得到的，具體方法是：

(1)用綠膿桿菌作為抗原免疫的產(chǎn)蛋雞，取其蛋，分離出蛋黃液；

(2)加入蛋黃液9倍體積的水溶解蛋黃液，調(diào)節(jié)pH5.0、4℃放置6小時(shí)；

(3)4℃下10000轉(zhuǎn)/分離心25min，取上清液；(4)加入18％硫酸鈉，溶解，室溫放置1h；

(5)常溫下10000轉(zhuǎn)/分離心15min，取沉淀；

(6)以與步驟(2)所用與蛋黃液等體積的0.01M、pH7.4的PBS溶解沉淀，加入14％硫酸鈉，溶解，室溫放置1h；

(7)常溫下10000轉(zhuǎn)/分離心15min，取沉淀；

(8)按步驟(7)所得沉淀質(zhì)量的20倍加入胃蛋白酶，并用水溶解，調(diào)節(jié)溶液pH3.5，加入適量甲苯，30℃水浴反應(yīng)1.5h；

(9)加入15％硫酸銨后調(diào)節(jié)pH5.0、57℃加熱30min，然后迅速降溫至45℃以下；

(10)4℃下10000轉(zhuǎn)/分離心15min，取上清液；

(11)調(diào)節(jié)上清液pH7.2，加入20％硫酸銨，4℃下8000轉(zhuǎn)/分離心15min，取沉淀；

(12)用去離子水溶解沉淀，加明礬至明礬在溶液中的濃度為0.8～1g/100ml，調(diào)節(jié)pH7.8，4C下8000轉(zhuǎn)/分離心15min，取上清液；

(13)加入38％硫酸銨，4℃下8000轉(zhuǎn)/分離心15min，取沉淀透析過濾除菌，即可；

上述方法中的物質(zhì)百分比濃度均為質(zhì)量/體積百分比(W/V)。

本發(fā)明抗綠膿桿菌Fab’片段具有產(chǎn)量高、效價(jià)好、理化性質(zhì)穩(wěn)定、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，并通過相關(guān)的體外實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明抗綠膿桿菌Fab’顯著拮抗綠膿桿菌的生長，可用于制備治療綠膿桿菌感染的藥物。

附圖說明

圖1是本發(fā)明抗綠膿桿菌Fab’片段抗綠膿桿菌效價(jià)檢測曲線。

圖2是本發(fā)明抗綠膿桿菌Fab’片段免疫印跡結(jié)果圖。

圖3是綠膿桿菌在本發(fā)明抗綠膿桿菌Fab’片段作用下的生長曲線，其中曲線◆為正常生長的綠膿桿菌的生長曲線，曲線■是綠膿桿菌在5mg/ml本發(fā)明抗綠膿桿菌Fab’片段作用下的生長曲線，曲線▲是綠膿桿菌在10mg/ml本發(fā)明抗綠膿桿菌Fab’片段作用下的生長曲線，曲線■是綠膿桿菌在20mg/ml本發(fā)明抗綠膿桿菌Fab’片段作用下的生長曲線。

具體實(shí)施方式疫原輔以完全福氏佐劑于雙翅膀皮下、雙大腿肌肉多處注射進(jìn)行免疫，首次免疫后每兩周加強(qiáng)免疫1次，共計(jì)免疫4次。首次免疫后2周開始收集雞蛋并保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)取步驟(1)所得雞蛋的蛋黃液，加入蛋黃液9倍體積的水溶解，調(diào)節(jié)pH5.0、4℃放置6小時(shí)；

(3)4℃下10000轉(zhuǎn)/分離心25min，取上清液；

(4)加入18％硫酸鈉，溶解，室溫放置1h；

(5)常溫下10000轉(zhuǎn)/分離心15min，取沉淀；