[發明專利]一種檢測核酸多態性的核酸擴增方法

有效

• 申請號: 200710093127.2
• 申請日: 2007-12-13
• 公開（公告）號: CN101280338A
• 公開（公告）日: 2008-10-08
• 發明（設計）人: 黃慶;府偉靈
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12P19/34
• 代理公司: 北京瑞盟知識產權代理有限公司
• 代理人: 孫民興;顧小曼

技術領域

本發明涉及一種核酸擴增方法，尤其是用于核酸多態性檢測的核酸擴增方法。

背景技術

單核苷酸多態性(single?nucleotide?polymorphisms，SNP)和基因突變等核酸多態性的檢測通常是利用多重PCR(polymerase?chain?reaction)技術，該技術的原理是在同一反應管中同時擴增多種靶分子，不但使分析通量大大提高，還可節省待檢樣本的靶分子核酸模板用量，但目前絕大多數的多重PCR方法均局限于同時擴增5-10個靶分子片段，其主要原因是n-重PCR必須加入n對不同的引物，即2n個引物，這使得PCR擴增反應的條件難以控制，此外，引物之間的相互作用很容易產生引物二聚集體和非特異性擴增。因此，多重PCR技術的瓶頸是如何在提高其擴增多重性的同時降低引物的使用量，從而使多重PCR成為真正的高通量核酸分析技術平臺。

通用引物是一種提高多重PCR策略的重要方法之一。在多重PCR的設計中，通用引物的設計通常采用一定的方式使之存在于待擴增的靶分子核酸模板或初級PCR擴增產物中，例如基于GoldenGate、MIP和SNPlex的多重PCR技術，從而可采用通用引物對靶分子序列進行高通量擴增，極大地提高多重PCR的多重性。

MIP技術(Hardenbol?P，Baner?J，Jain?M?et?al.Multiplexed?genotypingwith?sequence-tagged?molecular?inversion?probes.Nat?Biotechnol.2003；21(6)：673-678)和SNPlex技術(Tobler?AR，Short?S，Andersen?MR?et?al.TheSNPlex?genotyping?system：a?flexible?and?scalable?platform?for?SNPgenotyping.J?Biomol?Tech.2005；16(4)：398-406.)的探針結構雖然有較大差異，但方法基本相同，其主要過程是：1、探針中與靶基因互補的序列和靶基因雜交；2、在DNA聚合酶的作用下補平探針中與SNP位點相應的堿基，并通過連接酶將兩段序列連接；3、用限制性內切酶剪切設置在探針中引物序列部分的酶切位點，使探針線性化；4、以酶切后的探針作為模板加入引物進行PCR擴增；5、檢測擴增產物，根據步驟2補入的堿基可以判斷出靶基因SNP位點的序列。這兩種技術都需要利用酶切將與靶基因雜交后的探針線性化才能作為后續PCR擴增的模板，使操作變得復雜繁瑣，降低了檢測的效率，甚至有可能影響檢測的精確度。

GoldenGate技術(Shen?R，Fan?JB，Campbell?D?et?al.High-throughputSNP?genotyping?on?universal?bead?arrays.Mutat?Res.2005；573(1-2)：70-82)的特點是探針由兩條寡聚核苷酸鏈組成，每條鏈都包含了與引物序列和靶基因序列互補的兩個部分，其中一條鏈還含有標簽序列，另一條鏈與靶基因序列互補的部分的末端與靶基因的SNP位點相對應，當這兩條探針與靶基因雜交后，如果其中的一條探針中與靶基因序列互補的部分的末端與靶基因的SNP位點互補，則在DNA聚合酶的作用下以靶基因為模板延伸至另一條探針結合處，并通過連接酶將兩個片段連接，然后加入引物并以連接后的序列作為模板進行PCR擴增，最后檢測擴增產物，可根據探針中與靶基因的SNP位點相應的末端堿基來判斷SNP位點序列。這種方法雖然不需用酶切方法使PCR模板線性化，但是需用通過其中一條探針的延伸來實現兩條探針的連接，從而得到后續PCR的模板，因此，該技術仍沒有解決上述技術存在的缺陷。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提高用于核酸多態性檢測的核酸擴增方法的檢測效率。

本發明解決上述技術問題的技術方案是：

一種檢測核苷酸多態性的核酸擴增方法，該方法包括以下步驟：