[發明專利]一種檢測核酸多態性的核酸擴增方法

有效

• 申請號: 200710093127.2
• 申請日: 2007-12-13
• 公開（公告）號: CN101280338A
• 公開（公告）日: 2008-10-08
• 發明（設計）人: 黃慶;府偉靈
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12P19/34
• 代理公司: 北京瑞盟知識產權代理有限公司
• 代理人: 孫民興;顧小曼

1、一種檢測核酸多態性的核酸擴增方法，該方法包括以下步驟：

(1)設計并制備LDPP探針，所述的LDPP探針包括上游寡核苷酸單體和下游寡核苷酸單體；其中，上游寡核苷酸單體的5’-和3’-端分別是通用序列區和互補區，下游寡核苷酸單體的5’-和3’-端則分別是互補區和通用序列區；上游和下游寡核苷酸單體以頭-尾毗鄰的方式與靶分子的同一條核酸單鏈的相應序列互補，并且，在LDPP探針-靶分子雜交體中，上游和下游寡核苷酸單體的頭-尾之間僅僅存在一個堿基的間隙；

(2)設1～4個反應體系，每個反應體系均加入靶分子和至少一種LDPP探針，然后在三磷酸脫氧核糖核苷酸、DNA聚合酶和DNA連接酶存在的條件下進行聚合-連接反應，每個反應體系中所述的三磷酸脫氧核糖核苷酸分別為dATP、dTTP、dCTP和dGTP中的一種；

(3)以步驟(2)所得的反應產物作為反應模板，加入與LDPP探針相應的通用引物進行PCR擴增；所述的通用引物，其中一條通用引物與探針中一條寡核苷酸單體的通用序列區的序列相同，另一條通用引物則與探針中的另一條寡核苷酸單體的通用序列區的序列互補；

(4)檢測步驟(3)所得的擴增產物，根據每個反應體系的是否存在擴增產物及其豐度來進行定性和/或定量分析。

2、根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的LDPP探針還可以包括上游互補寡核苷酸單體和下游互補寡核苷酸單體，所述的上游互補寡核苷酸單體與上游寡核苷酸單體的互補區之外的部分或全部其它核酸序列互補，下游互補寡核苷酸單體則與下游寡核苷酸單體的互補區之外的部分或全部其它核酸序列互補。

3、根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的LDPP探針中的上游寡核苷酸單體和/或下游寡核苷酸單體中的通用序列區和互補區直接相連。

4、根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的LDPP探針中的上游寡核苷酸單體和/或下游寡核苷酸單體中的通用序列區和互補區之間存在間隔序列區，所述的間隔序列區具有通用性，其序列的最小長度為一個堿基，最大長度無限制，間隔序列相互之間可以相同或相似，但是與通用引物之間無交叉雜交，并且，所述間隔序列與待檢測物的物種基因組核酸序列無同源性或同源性較低。

5、根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的LDPP探針中的上游寡核苷酸單體和/或下游寡核苷酸單體中的通用序列區和互補區之間存在標簽序列區，所述的標簽序列區具有自身特異性，標簽序列的長度為10～40聚體的寡核苷酸，相互之間以及與通用引物之間無交叉雜交，并且，所述標簽序列與待檢測物的物種基因組核酸序列無同源性或同源性較低。

6、根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的LDPP探針中的上游寡核苷酸單體和/或下游寡核苷酸單體中的通用序列區和互補區之間存在酶切位點。

7、根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的將靶向不同靶分子的LDPP探針設計成不同長度的片段。

8、根據權利要求1所述的方法，其特征在于當靶分子是RNA或mRNA時，所述的LDPP探針的互補區還可以是Oligo?d(T)，Oligo?d(T)的長度是8～40聚體。

9、根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的LDPP探針的上游寡核苷酸單體、下游寡核苷酸單體、上游互補寡核苷酸單體和下游互補寡核苷酸單體中的一種或多種單體的5’-和/或3’-末端進行磷酸基團、羥基基團或其它類似基團的修飾或標記。

10、根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的LDPP探針的部分或全部堿基可以是堿基類似物或堿基修飾物。

11、根據權利要求1所述的方法，其特征是LDPP探針中的兩個靶分子互補區引入了人工錯配堿基，所述人工錯配堿基是天然的A、T、C、G四種堿基或其類似物。

12、根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)和/或步驟(3)加入的四種三磷酸脫氧核糖核苷酸中的一種或兩種以上標記熒光分子、發光基團、稀有元素或非熒光發色基團、生物素、地高辛分子、同位素、其它類似發光分子或適合分離或鑒別的標記分子。