[發明專利]甘露聚糖肽的制備方法

無效

• 申請號: 200710093103.7
• 申請日: 2007-12-04
• 公開（公告）號: CN101186942A
• 公開（公告）日: 2008-05-28
• 發明（設計）人: 馬宏偉;李麗;陳爽;曾康芬;江泉;王君山;艾琳;郭才旺
• 申請（專利權）人: 成都川抗萬樂藥業有限公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C12R1/46
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明涉及甘露聚糖肽的一種制備方法。

背景技術

甘露聚糖肽是從α-溶血鏈球菌(Streptococcus?hemolyticus-α-Hemolysis)H₁S-33號菌經深層發酵、分離提取的糖肽類物質。在哺乳動物體內能提升外周白細胞，增強網狀內皮系統吞噬功能，活化吞噬細胞及淋巴細胞，誘導胸腺淋巴細胞產生活性物質，改善和增強機體免疫功能和應激能力。臨床上主要用于惡性腫瘤放、化療中改善免疫功能低下的輔助治療。

甘露聚糖肽是一種高分子生物聚合物，其聚合程度和鏈長的不同使得其分子大小也不相同，通常α-溶血鏈球菌H₁S-33號菌的發酵產物中，甘露聚糖肽的重均分子量分布在1萬至100萬之間。研究表明，甘露聚糖肽的重均分子量太小，其免疫活性較低，太大則作為外源性生物大分子異物，能引起機體產生過敏等諸多不良反應。因此，作為藥用甘露聚糖肽，國家藥品標準規定：甘露聚糖肽原料藥的重均分子量應為40000～90000，注射用甘露聚糖肽用的重均分子量應為40000～65000。以此在確保療效的前提下，保證其異常毒性、過敏試驗、細菌內毒素等指標符合規定，確保用藥安全。

中國專利CN1172952C公開了一種“甘露聚糖肽組合物及其制備工藝和用途”，在其說明書3～4頁公開了甘露聚糖肽的制備方法，該方法的缺點是成本高、勞動強度大，收率低。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種甘露聚糖肽的制備方法，該方法成本低、收率高。

本發明甘露聚糖肽的制備方法包括如下步驟：

(1)制備發酵產物：α-溶血鏈球菌H₁S-33號菌的深層發酵液，經滅活、濃縮、乙醇沉淀得到含有甘露聚糖肽的發酵產物；

(2)提取、除雜質：發酵產物加3～10倍量(W/V)的純化水，在攪拌下進行提取，然后用三氯乙酸調節pH1.5～3.5，靜置、除去雜質得到清液；

(3)乙醇分級沉淀：將清液在攪拌下加濃度90％以上乙醇至20％～40％乙醇濃度，靜置4～24小時，分離沉淀，得一次沉淀物；清液繼續加濃度90％以上乙醇至50％～80％乙醇濃度，靜置4～24小時，分離沉淀，得二次沉淀物；

(4)一次沉淀物的水解：將一次沉淀物用溶菌酶、淀粉酶和纖維素酶中任意

一種或者用鹽酸、磷酸、乙酸和氫氟酸中任意一種進行水解。

上述步驟(4)中酶水解的步驟如下：一次沉淀物用5～20倍量(W/V)的純化水溶解，調整pH6.0～8.0，按500～100000U/g的量加入所述溶菌酶、淀粉酶和纖維素酶中任意一種，20～60℃保溫4～20小時，加熱至沸，冷卻至室溫，調整pH2.0～3.0，濾過，得甘露聚糖肽水溶液。

上述步驟(4)中酸水解的步驟如下：一次沉淀物用5～20倍量(W/V)濃度0.5～5％鹽酸、磷酸、乙酸和氫氟酸中任意一種溶液溶解，加熱60～105℃并保溫1～8小時，冷卻，調整pH值中性，得甘露聚糖肽水溶液。

口服用甘露聚糖肽原料的精制，將二次沉淀物溶于經過水解的一次沉淀物中，過濾至清，取樣測定重均分子量和分布寬度，合格者用濃度50～80％乙醇沉淀，靜置、離心或濾過分離沉淀物，干燥得甘露聚糖肽原料；不合格者，用超濾的方法去除小分子和大分子甘露聚糖肽，再用乙醇沉淀，靜置、離心或濾過分離沉淀物，干燥得口服用甘露聚糖肽原料。

注射用甘露聚糖肽原料的精制，將二次沉淀物溶于經過水解的一次沉淀物中，用5～20倍量(W/V)的蒸餾水溶解，按0.1～5％(重量)的比例加入活性炭，70～100℃保溫10～60分鐘，冷卻、濾過，清液用50～80％乙醇沉淀，靜置、離心或濾過分離沉淀物，無水乙醇或丙酮脫水后干燥得注射用甘露聚糖肽原料。

本發明是以α-溶血鏈球菌H₁S-33號菌的深層發酵產物為基礎，用純化水在攪拌下進行提取，用三氯乙酸沉除溶于水的蛋白雜質后，再用乙醇分級沉淀的方法將符合與超過藥用分子量標準規定的甘露聚糖肽分離出來，大分子甘露聚糖肽部分經酶解或酸解后，與分子量符合規定的甘露聚糖肽部分合并，用超濾的方法控制其重均分子量的分布寬度，再經活性炭吸附、乙醇沉淀、脫水干燥，得到符合藥用標準的甘露聚糖肽。

本發明的制備方法實用性強，工藝技術簡單易掌握、由于對大分子甘露聚糖肽的水解利用，生產成本降低、產品收率提高，與中國專利CN1172952C中的方法比較產品收率可增加60％以上，有利于在工業化生產中的推廣應用。

下面結合具體實施方式對本發明作進一步詳細的說明。

具體實施方式