[發(fā)明專利]高純度甘露聚糖肽的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710093102.2
• 申請(qǐng)日: 2007-12-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101186941A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬宏偉;李麗;陳爽;曾康芬;江泉;王君山;艾琳;郭才旺
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 成都川抗萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司
• 主分類號(hào): C12P21/02
• 分類號(hào): C12P21/02;C12R1/46
• 代理公司: 北京同恒源知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 趙榮之

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種高純度甘露聚糖肽的制備方法。

背景技術(shù)

甘露聚糖肽是從α-溶血鏈球菌(Streptococcus?hemolyticus-α-Hemolysis)H₁S-33號(hào)菌經(jīng)深層發(fā)酵、分離提取的糖肽類物質(zhì)。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)能提升外周白細(xì)胞，增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能，活化吞噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)胸腺淋巴細(xì)胞產(chǎn)生活性物質(zhì)，改善和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和應(yīng)激能力。臨床上主要用于惡性腫瘤放、化療中改善免疫功能低下的輔助治療。

甘露聚糖肽是一種高分子生物聚合物，其聚合程度和鏈長(zhǎng)的不同使得其分子大小也不相同，通常α-溶血鏈球菌H₁S-33號(hào)菌的發(fā)酵產(chǎn)物中，甘露聚糖肽的重均分子量分布在1萬(wàn)至100萬(wàn)之間。研究表明，甘露聚糖肽的重均分子量太小，其免疫活性較低，太大則作為外源性生物大分子異物，能引起機(jī)體產(chǎn)生過(guò)敏等諸多不良反應(yīng)。因此，作為藥用甘露聚糖肽，國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：甘露聚糖肽原料藥的重均分子量應(yīng)為40000～90000，注射用甘露聚糖肽用的重均分子量應(yīng)為40000～65000。以此在確保療效的前提下，保證其異常毒性、過(guò)敏試驗(yàn)、細(xì)菌內(nèi)毒素等指標(biāo)符合規(guī)定，確保用藥安全。

中國(guó)專利CN1172952C公開(kāi)了一種“甘露聚糖肽組合物及其制備工藝和用途”，在其說(shuō)明書(shū)3～4頁(yè)公開(kāi)了甘露聚糖肽的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種甘露聚糖肽產(chǎn)品純度高的制備方法。

本發(fā)明高純度甘露聚糖肽的制備方法包括如下步驟：

(1)制備發(fā)酵產(chǎn)物：α-溶血鏈球菌H₁S-33號(hào)菌的深層發(fā)酵液，經(jīng)滅活、濃縮、乙醇沉淀得到含有甘露聚糖肽的發(fā)酵產(chǎn)物；

(2)提取及粗品的制備：發(fā)酵產(chǎn)物加3～10倍量(W/V)的純化水，在攪拌下進(jìn)行提取，然后用三氯乙酸調(diào)節(jié)pH1.5～3.5，靜置、除去沉淀物，清液在攪拌下加濃度90％以上乙醇至40％～80％乙醇濃度，靜置，分離沉淀；沉淀物加純化水按步驟(2)反復(fù)溶解、沉淀，干燥得甘露聚糖肽粗品；

(3)大分子甘露聚糖肽的分離：用截留10～30萬(wàn)分子量的濾膜濾除甘露聚糖肽粗品中的大分子甘露聚糖肽，濾液用截留1～5萬(wàn)分子量的濾膜進(jìn)行濃縮處理，得甘露聚糖肽水溶液；

(4)大分子甘露聚糖肽的水解：將大分子甘露聚糖肽用溶菌酶、淀粉酶和纖維素酶中任意一種或者用鹽酸、磷酸、乙酸和氫氟酸中任意一種進(jìn)行水解。

上述步驟(4)中酶水解的步驟如下：大分子甘露聚糖肽用5～20倍量(W/V)的純化水溶解，調(diào)整pH6.0～8.0，按500～100000U/g的量加入所述溶菌酶、淀粉酶和纖維素酶中任意一種，20～60℃保溫4～20小時(shí)，加熱至沸，冷卻至室溫，調(diào)整pH2.0～3.0，濾過(guò)，得甘露聚糖肽水溶液。

上述步驟(4)中酸水解的步驟如下：大分子甘露聚糖肽用5～20倍量(W/V)濃度0.5～5％鹽酸、磷酸、乙酸和氫氟酸中任意一種溶液溶解，加熱60～105℃并保溫0.5～8小時(shí)，冷卻，調(diào)整pH值中性，得甘露聚糖肽水溶液。

口服用甘露聚糖肽原料的精制，將上述步驟(3)和步驟(4)所得甘露聚糖肽水溶液混合，過(guò)濾至清，取樣測(cè)定重均分子量和分布寬度，合格者用濃度50～80％乙醇沉淀，靜置、離心或?yàn)V過(guò)分離沉淀物，干燥得甘露聚糖肽原料；不合格者，用超濾的方法去除小分子和大分子甘露聚糖肽，再用乙醇沉淀，靜置、離心或?yàn)V過(guò)分離沉淀物，干燥得口服用甘露聚糖肽原料。

注射用甘露聚糖肽原料的精制，將上述步驟(3)和步驟(4)所得甘露聚糖肽水溶液混合，用5～20倍量(W/V)的蒸餾水溶解，按0.1～5％(重量)的比例加入活性炭，70～100℃保溫10～60分鐘，冷卻、濾過(guò)，清液用濃度50～80％乙醇沉淀，靜置、離心或?yàn)V過(guò)分離沉淀物，無(wú)水乙醇或丙酮脫水后干燥得注射用甘露聚糖肽原料。

本發(fā)明是將α-溶血鏈球菌H₁S-33號(hào)菌的深層發(fā)酵產(chǎn)物用純化水在攪拌下進(jìn)行提取，用三氯乙酸沉除溶于水的蛋白雜質(zhì)，經(jīng)乙醇反復(fù)沉淀的方法得到甘露聚糖肽粗品；粗品再用超濾的方法將符合與超過(guò)藥用分子量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的甘露聚糖肽分離出來(lái)，大分子甘露聚糖肽部分經(jīng)酶解或酸解后，與分子量符合規(guī)定的甘露聚糖肽部分合并，再經(jīng)活性炭吸附、乙醇沉淀、脫水干燥，得到符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的甘露聚糖肽。經(jīng)過(guò)上述超濾、水解步驟，本發(fā)明制得的甘露聚糖肽純度高，可達(dá)90～98％。

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1