[發(fā)明專利]人CD40L表達(dá)體系及其制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710093083.3
• 申請(qǐng)日: 2007-11-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101200715A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 田坤;錢桂生
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 田坤
• 主分類號(hào): C12N15/09
• 分類號(hào): C12N15/09;C12N15/12;C12N15/79
• 代理公司: 重慶志合專利事務(wù)所
• 代理人: 胡榮琿

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種真核表達(dá)體系，尤其涉及一種人CD40L?DNA表達(dá)體系及其制備方法。

背景技術(shù)

DNA重組技術(shù)(recombinant?DNA?technology)是生物工程體系中的重要組成部分。是指在基因水平上，根據(jù)需要以人工的方法取得供體上某個(gè)或某些有用的基因，在體外重組于載體DNA分子，然后將重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞進(jìn)行無(wú)性繁殖或行使正常功能。

DNA重組技術(shù)主要包括：①人工合成或從生物基因組中，獲取帶有目的基因的DNA片段；②選擇或改造作為載體的DNA；③將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇標(biāo)記的載體分子上，即DNA重組；④將重組DNA分子引入受體細(xì)胞；⑤從大量的細(xì)胞繁殖群體中篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞并擴(kuò)增，進(jìn)一步抽提、純化、擴(kuò)增得到目的基因；⑥將目的基因克隆到表達(dá)載體，導(dǎo)入受體細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下呈現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需的物質(zhì)。

該技術(shù)已廣泛用于基因工程藥物及各種疫苗的制備等研究領(lǐng)域。

CD40L(CD154)，是由261個(gè)氨基酸構(gòu)成的II型跨膜糖蛋白。它主要表達(dá)于激活態(tài)T淋巴細(xì)胞，尤其是CD4⁺T淋巴細(xì)胞表面。在免疫系統(tǒng)，該分子與相應(yīng)細(xì)胞CD40受體的相互作用對(duì)調(diào)節(jié)體液與細(xì)胞免疫反應(yīng)具有樞紐作用。一定狀態(tài)下，CD40L與腫瘤細(xì)胞表面CD40結(jié)合，可以直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖，增加抗腫瘤制劑的敏感性。更重要的是，CD40L一方面可以誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟，延長(zhǎng)DC細(xì)胞生存期，上調(diào)共刺激分子及內(nèi)源性腫瘤肽表達(dá)；另一方面可增加一些免疫刺激因子的分泌。從而提高DC的抗原呈遞效應(yīng)，促進(jìn)T效應(yīng)細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)了宿主抗腫瘤免疫的能力。以CD40L為組件的抗腫瘤疫苗的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究日益受到重視，諸多資料表明，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的抑癌效果令人欣慰，有望拓展于臨床領(lǐng)域。因此，建立人CD40L表達(dá)體系，為進(jìn)一步的臨床研究奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種人CD40L表達(dá)體系，使人CD40L在所需的受體細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，達(dá)到以人工的方式適度調(diào)整某些免疫反應(yīng)的目的，為相關(guān)臨床免疫研究奠定基礎(chǔ)，該體系具有以下特征：

含真核啟動(dòng)子的表達(dá)載體；

編碼SEQ?ID?NO：1的特異性人CD40L目的基因片段；

所述的表達(dá)載體在多克隆位點(diǎn)與CD40L目的基因片段重組。

本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，上述的CD40L目的基因片段SEQ?ID?NO：1序列為NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的編號(hào)為BC071754?CD40L序列中所載取的40至915間基因序列，共876個(gè)堿基。

本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，上述的表達(dá)載體含CMV和SV40真核啟動(dòng)子。

本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，上述的表達(dá)載體在多克隆位點(diǎn)具有Nhe?I和Kpn?I酶切位點(diǎn)。

本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，上述的表達(dá)載體為pcDNA3.1(+)載體除去多克隆位點(diǎn)Nhe?I與Kpn?I之間16個(gè)堿基的載體部分。

本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，上述的CD40L目的基因片段是由人激活態(tài)T淋巴細(xì)胞中獲取。

本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供一種制備上述的人CD40L表達(dá)體系的方法，制備中所用試劑均為市售分析純制劑。其主要包含以下步驟：

(1)CD40L目的基因的克隆；

(2)CD40L與pMD-18-T重組克隆載體的構(gòu)建；

(3)pMD-18-T-CD40L重組克隆載體的鑒定與純化；

(4)重組CD40L-表達(dá)載體的構(gòu)建；

(5)重組CD40L-表達(dá)載體陽(yáng)性質(zhì)粒的鑒定與純化；

(6)重組CD40L-表達(dá)載體陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞株；

(7)靶細(xì)胞株中CD40L目的基因表達(dá)的檢測(cè)。

本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，上述的CD40L目的基因的克隆引物為SEQ?ID?NO：2和SEQ?ID?NO：3的核苷酸序列。

其中，為便于定向重組載體的篩選，上述的SEQ?ID?NO：2所示序列的5’末端和上述的pMD18-T載體分別設(shè)有酶切位點(diǎn)Nhe?I和Kpn?I。

本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，上述的重組CD40L-表達(dá)載體中的表達(dá)載體為pcDNA3.1(+)載體除去多克隆位點(diǎn)Nhe?I與Kpn?I之間16個(gè)堿基的載體部分。

本發(fā)明所述的人CD40L表達(dá)體系，是借用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將該基因轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞，使CD40L在所需的細(xì)胞中表達(dá)，可以利用CD40L對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)機(jī)制，研究相應(yīng)臨床免疫，尤其是相關(guān)抗腫瘤免疫研究。