[發(fā)明專利]聯(lián)用積分法和初速度法測定酶活性的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710093081.4
• 申請日: 2007-11-30
• 公開（公告）號: CN101173889A
• 公開（公告）日: 2008-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 廖飛;趙運(yùn)勝;趙利娜;陸巍;楊曉蘭;廖紅;于明安;桑宇
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: G01N21/17
• 分類號: G01N21/17;G06F17/10;C12Q1/00
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于臨床檢驗、衛(wèi)生檢驗等領(lǐng)域測定酶活性的方法，其特征是用經(jīng)典初速度法測定低活性酶反應(yīng)體系的初速度，用積分法測定高活性反應(yīng)體系的酶反應(yīng)最大速度，通過換算成優(yōu)化底物濃度下的初速度，使積分法和初速度法的響應(yīng)曲線變成同一條直線，從而用較低的底物濃度獲得更高的線性響應(yīng)上限和更寬的線性響應(yīng)范圍，并保障分析效率。

背景技術(shù)

測定酶活性是臨床檢驗和環(huán)境衛(wèi)生檢驗等領(lǐng)域的常規(guī)工作。目前測定酶活性常用初速度法，但需用盡可能高的底物濃度以獲得較高的線性響應(yīng)上限和較寬的線性響應(yīng)范圍。當(dāng)?shù)孜锶芙舛扔邢蓿蚋邼舛鹊孜镉幸种苹蚣せ钭饔茫虻孜锍杀鞠拗茣r，經(jīng)典初速度法的線性范圍較窄。用積分速度方程分析酶反應(yīng)過程可測定酶活性，此即積分法。經(jīng)典積分法為降低計算工作量將積分速度方程轉(zhuǎn)換成線性形式，但所用方程的自變量含隨機(jī)誤差，且易受反應(yīng)起點誤差等的影響，可靠性太低而無法應(yīng)用。隨著常規(guī)計算能力的顯著提高，用以反應(yīng)時間為自變量的積分速度方程非線性擬合酶反應(yīng)動力學(xué)過程曲線成為新的酶反應(yīng)動力學(xué)過程分析方法，此即新積分法，其所用底物濃度更低而線性響應(yīng)上限更高。積分法要求被分析數(shù)據(jù)中底物消耗比例越高越好，其初始底物濃度越低則對底物消耗最低比例要求也越低，但其下限一般在40％左右。因此，當(dāng)待測樣品活性低時，就需很長的測定時間記錄酶反應(yīng)的動力學(xué)過程，使得其分析效率無法得到保證。另外，現(xiàn)有偶聯(lián)酶反應(yīng)體系都要求偶聯(lián)工具酶活性盡可能高，否則線性上限很低，而用積分法分析偶聯(lián)酶反應(yīng)動力學(xué)過程至今沒有成為常規(guī)方法。

經(jīng)典初速度法測定酶活性的最大優(yōu)勢是分析效率高，而積分法的最大優(yōu)勢是在更低的底物濃度下線性響應(yīng)上限卻更高。理論上預(yù)期，將積分法與初速度法聯(lián)用有望在較低底物濃度下既提高測定效率，又顯著提高線性響應(yīng)上限，從而有效拓寬線性響應(yīng)范圍。這種策略已嘗試過(見Biochem?J，1975，149：305-312；Biochem?J，1982；203：117-123；Biochem?J，1985；228：55-60)，但這些嘗試中，當(dāng)被分析的酶反應(yīng)曲線中底物消耗比例超過50％以后反而偏差越來越大，尤其對反應(yīng)起點誤差和初始底物濃度誤差也很敏感，不能常規(guī)應(yīng)用。

此前嘗試的聯(lián)用方法中所用積分速度方程的自變量都不是反應(yīng)時間，都含有隨機(jī)誤差和系統(tǒng)誤差，這可能是其可靠性低的原因。但如用以反應(yīng)時間為自變量的積分速度方程分析酶反應(yīng)過程，有望使積分法測定酶活性對反應(yīng)起點誤差不明感，在底物消耗比例較高時可靠性更高，從而可同經(jīng)典初速度法聯(lián)用測定酶活性而拓寬線性響應(yīng)范圍，并保障分析效率。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是聯(lián)用積分法和經(jīng)典初速度法測定酶活性，從而用中等底物濃度獲得更高的線性響應(yīng)上限和更寬的線性響應(yīng)范圍，并保障分析效率。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：用中等底物濃度，在酶活性足夠高時，對偶聯(lián)酶反應(yīng)用積分法測定初速度、對單一酶反應(yīng)用積分法測定最大反應(yīng)速度再換算成優(yōu)化初始底物濃度下的初速度；在酶活性較低時，直接用經(jīng)典初速度法測定酶活性。此聯(lián)用方法的關(guān)鍵是兩種方法測定酶活性對酶量線性響應(yīng)斜率相同，對兩種方法都能測定的酶樣品給出相同的酶活性，其特征在于：

(一)、取一定量所需緩沖液加入試管內(nèi)，再加入一定量底物溶液；單一酶反應(yīng)體系的初始底物濃度在待測酶米氏常數(shù)0.10到10倍之間；對偶聯(lián)一個工具酶的偶聯(lián)酶反應(yīng)體系，待測酶的底物濃度設(shè)置與用經(jīng)典初速度法完全相同(即待測酶的底物濃度高于對應(yīng)米氏常數(shù)的10倍，偶聯(lián)工具酶的指示底物濃度為檢測儀器線性響應(yīng)范圍的上限或盡可能高)；

(二)、將上述溶液混勻后在選定溫度(25～37℃)下恒溫5～10分鐘；

(三)、在上述溶液中加入待測酶液，立即混勻，迅速將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到比色杯(或其它可連續(xù)監(jiān)測酶反應(yīng)過程的檢測器樣品室)；

(四)、延遲15秒，以1～30秒間隔記錄對待測底物或產(chǎn)物線性響應(yīng)的檢測信號(如光吸收)，共記錄3分鐘以上(10分鐘以內(nèi))獲得底物或產(chǎn)物隨時間變化的反應(yīng)曲線(偶聯(lián)酶反應(yīng)體系用1秒間隔記錄)，監(jiān)測反應(yīng)的時間不超過10分鐘；

(五)、數(shù)據(jù)過濾，去掉相鄰數(shù)據(jù)點中對應(yīng)的檢測信號變化小于儀器檢測噪聲2倍的數(shù)據(jù)(即去掉底物或產(chǎn)物濃度無顯著變化的數(shù)據(jù))；

(六)、將單一酶單底物反應(yīng)微分速度方程積分成以反應(yīng)時間為自變量的形式，將偶聯(lián)一個工具酶的微分速度方程數(shù)值積分成以反應(yīng)時間為自變量的形式(數(shù)值積分步長0.1秒)，如存在產(chǎn)物抑制則在此積分速度方程中需包含產(chǎn)物抑制的效應(yīng)。