[發明專利]聯用積分法和初速度法測定酶活性的方法

無效

• 申請號: 200710093081.4
• 申請日: 2007-11-30
• 公開（公告）號: CN101173889A
• 公開（公告）日: 2008-05-07
• 發明（設計）人: 廖飛;趙運勝;趙利娜;陸巍;楊曉蘭;廖紅;于明安;桑宇
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學
• 主分類號: G01N21/17
• 分類號: G01N21/17;G06F17/10;C12Q1/00
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1.一種聯用積分法和初速度法測定酶活性，從而用中等底物濃度和較高效率獲得更寬線性響應范圍的方法，其特征在于按如下步驟進行：

(一)、取一定量所需緩沖液加入試管內，再加入一定量底物溶液，單一酶的單底物反應體系初始底物濃度在待測酶米氏常數0.10到10倍之間，偶聯一個工具酶的反應體系所需各種底物濃度及工具酶活性與用初速度法測定偶聯酶反應體系酶活性時完全相同(即待測酶的底物濃度高于其米氏常數的10倍，偶聯工具酶活性盡可能高，指示底物濃度為檢測儀器線性響應范圍的上限)；

(二)、將上述溶液混勻后在選定溫度(25～37℃)下恒溫5～10分鐘；

(三)、在上述溶液中加入待測酶液樣品，立即混勻，迅速將反應混合物轉移到比色杯(或其它可連續監測酶反應過程的分析儀器的樣品室)；

(四)、延遲20秒，以1～60秒間隔監測與底物或產物成比例的檢測信號(如光吸收)，共記錄3分鐘到10分鐘(偶聯酶反應體系記錄間隔應盡量短)；

(五)、數據過濾，去掉相鄰數據點中檢測信號變化小于儀器檢測噪聲2倍的數據(即去掉底物或產物濃度無顯著變化的數據)，換算成底物或產物濃度隨時間變化的反應曲線；

(六)、將單一酶單底物反應微分速度方程積分成以反應時間為自變量的積分速度方程，將偶聯一個工具酶的微分速度方程數值積分成以反應時間為自變量的積分速度方程；如有底物或產物抑制則在積分速度方程中包含其抑制效應；

(七)、在設定條件下，如所記錄反應曲線中對應的最高底物濃度高于酶作用前的70％，且分析底物消耗10％范圍內數據的平均速度(即經典初速度)仍低于初速度法的線性上限時，則用初速度法確定其經典初速度表示酶活性；

(八)、當反應進行到記錄總時間80％時(記錄總時間為6分鐘則此時間約4.5分鐘)，如單一酶單底物體系的底物消耗比例高于積分法所要求下限(一般約40％，初始底物濃度太低或太高時此底物消耗比例的下限更高)，則以最大反應速度及初始底物濃度(或相當的對應物理量)為參數，其余動力學參數固定為已知常數，用以反應時間為自變量的積分速度方程非線性擬合反應曲線確定對應的最大反應速度，此即用積分法測定單一酶體系的酶活性；當偶聯一個工具酶反應體系指示底物消耗比例高于積分法所要求的下限(一般為75％，指示底物的濃度不同、工具酶的動力學參數不同時此底物消耗比例要求的下限也不同)時，則用待測酶反應初速度和偶聯酶指示底物濃度為參數，用對應的數值積分速度方程(數值積分步長0.1秒，盡可能短)迭代擬合酶反應曲線，達到最好擬合的待測酶反應初速度為待測參數，此即用積分法測定偶聯酶反應體系的酶活性；

(九)、對單一酶反應體系，用其微分速度方程和固定為常數的其它動力學參數，將積分法所得最大反應速度換算成在所用反應體系初始底物濃度93％(隨初始底物濃度變化，但波動在4％以內)底物濃度下的初速度，此即用積分法所得單一酶反應體系的計算初速度；優化最大反應速度換算成計算初速度所用的底物濃度以同時滿足下列兩個要求：(1)計算初速度對酶量的響應曲線斜率同低酶活性范圍內經典初速度對酶量的響應曲線斜率無統計差異，(2)對初速度法能可靠測定而此積分法也能可靠測定的酶活性交叉區域內的樣品，用積分法所得的計算初速度同初速度法所得的經典初速度也無統計差異。

2.據權利要求1所述聯用積分法與初速度法測定酶活性的方法，其特征在于：如步驟(七)到步驟(九)所述，當單一酶反應體系所記錄的反應起始階段的底物濃度仍高于酶作用前的70％且對應的經典初速度仍在初速度法的線性范圍內，則用初速度法測定經典初速度表示酶活性；當所設定記錄時間80％內底物消耗比例已高于所用實驗條件下積分法測定酶活性所要求的底物消耗比例下限，就用以反應時間為自變量的積分速度方程，以初始底物濃度(或最大產物濃度等相當的物理量)、最大反應速度為待測參數，其余所需動力學或熱力學參數為固定常數，非線性擬合酶反應過程確定最大反應速度，再按照步驟(九)所述換成成計算初速度表示酶活性；此特征不同于單用積分法測定酶活性。

3.據權利要求1所述聯用積分法與初速度法測定酶活性的方法，其特征在于：如步驟(一)中所述，對于單一酶反應體系，此聯用方法所需底物濃度不需高于酶米氏常數的10倍而且變化范圍很寬，所需記錄反應過程的總時間在3到10分鐘之間，就可獲得比經典初速度法更高的線性響應上限。