[發明專利]基于積分球增強光散射檢測技術的均相親和分析新方法

無效

• 申請號: 200710092738.5
• 申請日: 2007-09-24
• 公開（公告）號: CN101178360A
• 公開（公告）日: 2008-05-14
• 發明（設計）人: 廖飛;陸巍;謝國明;鄧萍;楊曉蘭;于明安
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N33/48
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種在親和分析過程中，用本身為多活性位點的生物分子或通過特殊策略獲得的多活性位點共價加合物，與帶強生色團標記的對應生物活性成分結合，生成有強光散射能力的非共價產物團聚物，并在熒光分光光度計等可測量光散射的儀器上，用安裝有圓柱形流式樣品管的積分球，顯著提高光散射信號的測量比例；聯用這兩種策略，建立不需分離出產物復合物的均相親和分析新方法，用于測定生物活性分子含量及相互作用的親和力，其特征在于按如下步驟進行：

(一)、在親和分析的反應體系中，用特殊策略生成有強光散射能力的非共價產物團聚物，其特征在于按如下步驟進行：

(1).將單活性位點生物分子的標準品，與含多個相同活潑官能團的樹狀分子或其它有類似功能的分子交聯，生成多活性位點共價加合物；本身為多活性位點的生物分子不需交聯；

(2).將可與本身為多活性位點的生物分子或按步驟(1)所得的多活性位點共價加合物相結合的對應生物活性成分標準品，用有強光散射能力的生色團(如納米金或銀粒子、水溶性卟啉類物質)進行標記；

(3).將本身為多活性位點的生物分子對應標準品或按步驟(1)所得的多活性位點共價加合物，與按步驟(2)所得帶強光散射能力生色團標記的生物活性成分相結合，生成有強光散射能力的非共價產物團聚物；

(4).測定本身為多活性位點生物分子的含量時，用設定量的帶強光散射能力生色團標記的對應生物活性成分直接與待測樣品反應，生成有強光散射能力的非共價產物團聚物；反應達平衡后，所生成的這種非共價產物團聚物的量，與來自樣品的待測多活性位點生物分子的含量正相關；

(5).測定單活性位點生物分子的含量時，先按步驟(1)制備相應的多活性位點共價加合物；測定時先將待測樣品與此多活性位點共價加合物混勻，再加入設定量的帶強生色團標記的對應生物活性成分，使其發生競爭結合；達到平衡后，所生成的有強光散射能力的非共價產物團聚物的量，與來自樣品的待測單活性位點生物分子的含量負相關；

(6).測定與按步驟(2)所制備的帶強光散射能力生色團標記的生物活性成分結合性質相同的生物分子含量時，先將待測樣品與帶強光散射能力生色團標記的該生物活性成分標準品混勻，再加設定量的本身為多活性位點的相應生物分子或按步驟(1)所制備的相應多活性位點共價加合物，使其發生競爭結合；反應達到平衡后，所生成的有強光散射能力的非共價產物團聚物的量，與來自樣品的待測生物活性分子的含量負相關；

(7).測定生物活性分子之間親和力時，令本身為多活性位點的生物分子或按步驟(1)所制備的多活性位點共價加合物為A，按步驟(2)所制備的帶強光散射能力生色團標記的對應生物活性成分為B；在反應體系中固定A和B的濃度且二者比例接近1∶1；測定時，先在反應體系中加入待測成分(使其濃度在盡可能寬范圍內變化)，再加入與此待測成分有相同結合性質的生物活性成分(A或B)，混勻后加入設定量的可與待測成分結合的生物活性成分(B或A)，使其發生競爭結合；反應達平衡后，所生成的有強光散射能力的非共價產物團聚物的量與外加待測成分的量負相關；再用Scatchard作圖法分析所生成的有強光散射能力的非共價產物團聚物的量對外加待測成分量的響應，確定解離常數表示二者之間相互作用的親和力；

(8).在步驟(2)中，還可用一對有熒光共振能量轉移效應的生色團分別標記同一種生物活性成分，將二者等比例混勻后，再與本身為多活性位點的相應生物分子或步驟(1)所得的相應多活性位點共價加合物結合，使其生成有強熒光共振能量轉移效應的非共價產物團聚物；然后參照步驟(4)到步驟(7)表征生物分子間的相互作用。

(二)、用安裝有流式樣品管的積分球(其規格與所用熒光分光光度計等測量儀器相匹配。以下所述積分球及圓柱形流式樣品管的參數均與Shimadzu?RF-540熒光分光光度計匹配)，匯聚在三維空間不均勻分布的光散射或熒光信號用于檢測，其特征在于按如下步驟進行：

(1).用石英或玻璃制造圓柱形流式樣品管(內徑0.40cm，外徑0.60cm，長2.5cm)；測量前用緩沖液以流動注射方式清洗；

(2).制造用于匯聚光散射信號的積分球；在此積分球壁上開三個園孔(分別正對熒光分光光度計等光散射信號測量儀器的激發窗口和檢測窗口的兩園孔直徑都為0.62cm；用于導出透射光的園孔直徑為0.82cm)；其中，孔中心連線過積分球球心的一對園孔用于安置圓柱形流式樣品管(使圓柱形流式樣品管的軸心線與熒光分光光度計等光散射信號測量儀器的激發窗口軸心線盡量重合)，另一園孔作為光散射匯聚后進入檢測窗口的出口(作為光散射出口的園孔，其軸心線與熒光分光光度計等光散射信號測量儀器檢測窗口的軸心線盡量重合)；將透射光用內部強吸光的玻璃直管(內徑0.61cm，外徑0.81cm)引導到積分球以外，樣品管、導光管與積分球壁上園孔之間的空隙都用合適的墊圈密封；將焦距60cm的匯聚鏡(焦距應遠遠大于所用積分球的直徑)安裝在激發窗口和圓柱形流式樣品管之間，將激發光匯聚成焦點位于積分球以外的近平行激發光(避免激發光透過樣品管直接進入積分球內而造成很高的背景)，并垂直地照射到圓柱形樣品管針對激發窗口的底面上；

(3).將激發光通路和圓柱形流式樣品管用內徑3.0cm的不透光塑料直管連接(此直管的軸心線與激發光通路的軸心線盡量重合)，將積分球匯聚的散射光經出射園孔與檢測窗口用內徑3.0cm的不透光塑料直管連接(此直管的軸心線與檢測窗口的軸心線盡量重合)，盡可能降低背景和雜散光；

(4).用注射器手動或步進馬達自動把適量液體樣品輸送到圓柱形流式樣品管內；

(5).用安裝了積分球的熒光分光光度計等光散射測量儀器，測量光散射強度；

(6).與(一)中所述步驟(8)對應，用安裝了積分球的熒光分光光度計等儀器，測量共振能量轉移所產生的熒光。