[發明專利]中國黃牛成熟疊朊蛋白及其多克隆抗體的制備方法

無效

• 申請號: 200710089246.0
• 申請日: 2007-03-16
• 公開（公告）號: CN101050459A
• 公開（公告）日: 2007-10-10
• 發明（設計）人: 張杰;劉永生;路偉;孫德惠;陳豪泰;劉湘濤;才學鵬
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N15/12;C07K14/47;G01N33/68;C07K16/18;G01N33/53
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司
• 代理人: 張晉

技術領域

本發明涉及一種采用基因工程方法制備一種抗原蛋白和用這種蛋白制備免疫抗體的方法，以及這種蛋白和相應抗體的用途，更確切講，本發明涉及制備中國黃牛成熟疊朊蛋白及其多克隆抗體，以及這種蛋白和抗體的用途。

背景技術

盡管諾貝爾獎獲得者Prusiner?SB的“唯蛋白”理論指出，瘋牛病、癢病和人變異性克雅氏病等傳染性海綿狀腦病(Transmissible?SpongiformEncephalopathy，TSE)是由一種不含有核酸的蛋白質----朊病毒(Scrapie?PrionProtein，PrP^Sc)導致的，但是其發病機理至今仍不清楚。PrP^Sc是由PrP^C(Cell?PrionProtein，細胞型朊蛋白)構象發生轉變后產生的，但是其轉換機制尚不清楚。近年來的研究表明，與PrP^C結構相似的一種蛋白質----疊朊蛋白(Dopple，Dpl)與TSE的發病息息相關。Dpl是由Prnd基因編碼的約179個左右氨基酸殘基組成的糖蛋白，它是PrP^C的橫向同源物，兩者翻譯后的修飾和空間結構非常相似。Dpl主要在睪丸中表達，在中樞神經系統的表達量很低。Dpl體現兩個方面的功能：一是生殖功能，敲除Prnd基因的雄性小鼠喪失了生育能力；另一方面是神經功能，因為敲除PrP^C編碼基因的小鼠沒有出現明顯的神經和精神癥狀，所以，學者推測Dpl可能具有部分替代PrP^C功能的作用。但是另一方面，研究又表明Dpl具有神經毒性作用，在腦組織中過量表達Dpl會導致小鼠出現共濟失調現象。有趣的是PrP^C會將小鼠從Dpl誘導的共濟失調中拯救出來，這表明PrP^C通過直接與Dpl作用或者通過共配體或者共受體的方式中和了Dpl的神經毒性作用。這些研究意味著Dpl與PrP^C、甚至與PrP^Sc可能有著密切的關系，但是目前它們間的相互作用關系尚不清楚。所以，通過各種手段了解Dpl的結構與功能對闡明Dpl在TSE發病中的作用具有重要意義。抗體是研究蛋白質結構與功能的重要工具，因此，制備出針對Dpl的相應抗體對深入研究Dpl具有重要意義。

Dpl是一種糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定的膜蛋白，其前體形式是由氨基端的信號肽(牛Dpl信號肽為1-26位氨基酸殘基)、中間的成熟Dpl(牛成熟Dpl為從第27位至第155位氨基酸殘基組成)和羧基端的GPI結合區(牛Dpl該區從第156位至第179位氨基酸殘基組成)組成。Dpl的ORF位于一個單一的外顯子內，其編碼的Dpl前體在蛋白質的翻譯后修飾過程中切除了氨基端信號肽和羧基端GPI結合區的氨基酸殘基，添加上GPI錨，形成成熟Dpl，主要分布在睪丸組織中。由于直接制備來源于牛睪丸組織的Dpl，不僅受材料限制，而且獲得的量很少，不易純化。所以，以牛睪丸組織為實驗材料不利于免疫原制備。

在抗牛Dpl多克隆抗體(以下簡稱為多抗)制備方面，國外學者制備出了針對本土牛Dpl的多抗，應用于Dpl的免疫印跡(Western?Blotting)、免疫組化等方面。研究表明，中國黃牛Dpl的編碼基因BoPrnd(在GenBank中的登錄號為DQ408532)的開放閱讀框(ORF)為537bp，與GenBank登錄的國外其它牛Prnd的ORF的最高同源性為99％(534/537)，例如DQ205538，NM174158和BTA278011序列，分別在第149、395和438位發生G→A，G→A和C→G的改變，相應地引起氨基酸發生了R(精氨酸)50H(組氨酸)，H(組氨酸)146Q(谷氨酰胺)的改變。發生改變的這兩個氨基酸位于牛成熟Dpl內，這表明中國黃牛成熟Dpl的氨基酸序列不同于國外本土牛的成熟Dpl氨基酸序列。所以，不使用牛睪丸組織獲得中國黃牛成熟Dpl，以及制備針對中國黃牛成熟Dpl的多抗，對研究中國黃牛Dpl的結構與功能具有一定意義，能夠為研究工作提供有力實驗工具，并對中國畜牧業的發展產生積極的作用。但現階段尚缺乏這方面的披露。

發明內容

本發明的目的之一是提供一種中國黃牛成熟疊朊蛋白的制備方法和由此方法得到的中國黃牛成熟疊朊蛋白，本發明的目的之二是提供中國黃牛成熟疊朊蛋白的多克隆抗體的制備方法以及這種多克隆抗體，本發明的目的之三是提供中國黃牛成熟疊朊蛋白和中國黃牛成熟疊朊蛋白多克隆抗體的用途。