[發明專利]產1,3－丙二醇氧化還原酶的工程菌及其酶制備方法

無效

• 申請號: 200710084620.8
• 申請日: 2007-02-11
• 公開（公告）號: CN101063106A
• 公開（公告）日: 2007-10-31
• 發明（設計）人: 方柏山;夏啟容
• 申請（專利權）人: 華僑大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N9/02;C12R1/19
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發明技術領域

本發明涉及一種產1，3-丙二醇氧化還原酶的基因工程菌及其1，3-丙二醇氧化還原酶制備方法，也即一種產PDOR的基因工程菌及其PDOR制備方法。屬于基因工程和酶工程技術領域。

背景技術

1，3-丙二醇(1，3-propanediol，下稱1，3-PD)是一種重要的環保型化工原料，主要是作為聚酯、聚醚和聚亞氨酯的單體，在地毯、工程塑料、服裝面料等領域用途廣泛，在國際市場上供不應求。1，3-PD的合成有化學法和生物法兩種。目前，生物法生產1，3-PD雖還處于實驗室研究或中試階段，但從環境保護及長遠發展來看，生物法更具有生命力。1999年Biebl等人在德國《應用微生物和生物工藝學》(52卷289-297頁)中總結，已發現幾種能以甘油為底物發酵生產1，3-PD的菌種，主要有腸道細菌中的克雷伯肺炎桿菌屬(Klebsiella?pneumoniae)、產氣克雷伯菌屬(Klebsiella?aerogenes)、腸細菌屬(Enterobacter?agglomerans)、弗氏檸檬菌(Citrobacterfreundii)以及乳桿菌屬的短乳桿菌(Lactobacilli?brevis)和布氏乳桿菌(Lactobacilli?buchneri)、梭菌屬的丁酸梭狀芽孢桿菌(Clostridia?butyricum)和巴氏梭狀芽孢桿菌(Clostridia?pasteuianum)等。Deckwer于1995年在歐洲《FEMS微生物綜述》(16卷143-9頁)中提出，K.pneumoniae、C.butyricum和C.freundii具有較高的1，3-PD轉化率及生產能力，是研究得比較多的三種菌。C.butyricum具有良好的1，3-PD耐受力，但是該菌屬于嚴格厭氧菌，培養條件苛刻。K.pneumoniae屬兼性厭氧菌，屬于病原菌，但實驗所用菌株較為溫和，在實驗室范圍內未見有其致病的報道，因此是比較適宜的1，3-PD生產菌。

1998年Ahrens在美國《生物工程與工藝》(59卷第5期544-552頁)上發表，甘油轉化為1，3-PD的厭氧代謝途徑中，甘油沿著氧化和還原兩條平行路徑代謝。在氧化途徑中，甘油在依賴于NAD⁺的甘油脫氫酶(glycerol?dehydrogenase，下稱GDH，EC?1.1.1.6)的作用下形成二羥基丙酮(dihydroxyacetone，下稱DHA)，再在二羥基丙酮激酶(dihydroxyacetone?kinase，下稱DHAK，EC?2.7.1.29)的作用下，生成二羥基丙酮磷酸(digydroxyacetonephosphate，下稱DHAP)，然后進入糖酵解途徑，這一代謝過程是以甘油為底物生長的微生物的共同代謝途徑，為微生物生長提供ATP和NADH。在還原途徑中，甘油在以維生素B₁₂為輔酶的甘油脫水酶(glyceroldehydratase，下稱GDHt，EC?4.2.1.30)的作用下生成3-羥基丙醛(3-hydroxypropionaldehyde，下稱3-HPA)，然后在依賴于NADH的1，3-丙二醇氧化還原酶(1，3-propanedioloxidoreductase，下稱PDOR，EC?1.1.1.202)的作用下形成1，3-PD。還原途徑所需的NADH由氧化途徑提供，整個過程伴隨著輔酶I的再生。在甘油轉化成1，3-PD的過程中，GDH、GDHt和PDOR是關鍵酶，它們的活力與1，3-PD的產率密切相關。

GDH、GDHt和PDOR是由dha操縱子上的不同基因編碼的，已有人利用基因工程技術對菌種進行改造，Tong(1991年美國《應用環境微生物》57卷3541-46頁)將來自于Klebsiellapneumoniae的dha操縱子在大腸桿菌中表達生產1，3-PD，Rolf在1995年美國《細菌學》(177卷2151-6頁)中發表，將Citrobacter?freundii上的1，3-丙二醇脫氫酶基因在大腸桿菌中表達，但從成本和生產能力上看都達不到工業生產的要求。另外，杜邦公司申請了用單一微生物由葡萄糖發酵制備1，3-PD的專利(《一種高濃度生產1，3-丙二醇的生物法》2001年美國專利，WO.01/12833?A2)。

發明內容

本發明的目的是提供采用基因重組的方法構建能高產PDOR的工程菌，其生產成本低、生產能力高、能達到工業生產的要求；并提供其較低成本的發酵生產PDOR的方法。

本發明以如下方式實現：

1、菌種和質粒