[發明專利]產1,3－丙二醇氧化還原酶的工程菌及其酶制備方法

無效

• 申請號: 200710084620.8
• 申請日: 2007-02-11
• 公開（公告）號: CN101063106A
• 公開（公告）日: 2007-10-31
• 發明（設計）人: 方柏山;夏啟容
• 申請（專利權）人: 華僑大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N9/02;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1、一種產PDOR的基因工程菌，其特征是：

?A、材料

克雷伯肺炎桿菌(Klebsiella?pneumoniae?DSM?2026)，E.coli?BL21(DE3)，pMD18-T，質粒pET-15b，上述材料在尊重保護知識產權的情況下均方便獲得或購得；

B、生產PDOR工程菌的構建

用煮沸法從Klebsiella?pneumoniae?DSM?2026菌株上提取總DNA；

以5’-GGCCCATATGAGCTATCGTATGTTTGATTATC-3’為前引；

5’-ACTTGGATCCTCAGAATGCCTGGCGGAAAAT-3’為后引；

采用PCR擴增得到目的基因dhaT，1％瓊脂糖電泳分離，切膠回收；

參照美國Sambrook等編寫的《分子克隆實驗指南》第三版的基因插入方法，將目的基因dhaT插入pMD18-T，得到重組質粒pMD-dhaT，再將pMD-dhaT和pET-15b分別用Nde?I和BamH?I酶切，按照T4?DNA?Ligation(Biolab)的說明書設計連接體系，并進行粘端連接，連接產物轉化至用CaCl₂法制備的感受態BL21(DE3)；

用100μg/mL氨芐青霉素(ampicillin，Amp)的LB平板培養，37℃過夜，挑取8-10個菌落，用含75μg/ml?Amp的LB培養基進行增菌培養3-12h(37℃，250rpm)，用質粒抽提試劑盒(Omega)提取質粒，用Nde?I和BamH?I進行雙酶切鑒定，選擇一個含陽性重組質粒pET-dhaT的菌株，即為重組大腸桿菌BL21(DE3)-pET-dhaT，也即一種產1，3-丙二醇氧化還原酶的基因工程菌。

2、應用本發明構建的產PDOR的基因工程菌發酵培養制備PDOR的方法，其特征是：

將活化的重組大腸桿菌BL21(DE3)-pET-dhaT菌液接種于(1-5％的接種量)含0-150μg/mLAmp的LB培養基中，25-39℃培養0.5-2h，加入誘導劑至終濃度，若以IPTG作誘導劑時為0.05-1mM，以乳糖為2-200mM，進行誘導；繼續于15-28℃發酵培養3-12h；發酵液于6000rpm，1℃下離心10min，收集菌體，加入發酵液體積1/20-1/50量的結合緩沖液(20mM?Na₃PO₃，0.5MNaCl，pH?7.5-8.5)或Tris緩沖液(pH7.3-8.5)懸浮，用溶菌酶、超聲波等生物或物理方法進行細胞破壁，經離心，上清液即為PDOR的無細胞抽提液；再經進一步分離、提取等純化操作得PDOR。