[發(fā)明專利]表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2基因編碼蛋白永生化細(xì)胞制備方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710084568.6
• 申請(qǐng)日: 2005-03-08
• 公開（公告）號(hào): CN101139589A
• 公開（公告）日: 2008-03-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周繼勇;葉菊秀;陳慶新;鄭肖娟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/09
• 分類號(hào): C12N15/09;C12N15/33;C12N15/85;C12N5/10;C12N15/86;A61K39/12
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 張法高

本發(fā)明是申請(qǐng)日為2005年3月8日，申請(qǐng)?zhí)枮?00510049306.7，發(fā)明名稱為：表達(dá)傳染性法氏囊病毒基因編碼蛋白永生化細(xì)胞制備方法的分案申請(qǐng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)和細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2基因基因編碼蛋白永生化細(xì)胞制備方法。本發(fā)明具有深遠(yuǎn)的研究性和廣泛的應(yīng)用性，包括用于研究宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)具有穩(wěn)定性及可表達(dá)所需蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的永生化。

背景技術(shù)

傳染性法氏囊病(IBD)是由傳染性法氏囊病毒(IBDV)引起的一種以損害雞中樞免疫器官-法氏囊淋巴濾泡未成熟細(xì)胞為特征的急性高度接觸性免疫抑制性傳染病。1957年Cosgrove在美國(guó)Delaware的Gamboro鎮(zhèn)首先發(fā)現(xiàn)此病，1962年Winterfield分離鑒定出IBDV。該病在美國(guó)及世界各國(guó)均有發(fā)生和流行。88-92年IBD在我國(guó)大面積爆發(fā)，發(fā)病率和死亡率高達(dá)30-70％，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，IBD的發(fā)生和流行出現(xiàn)了新的特征，即由臨床感染轉(zhuǎn)化為以亞臨床感染為主、死亡率降低、免疫抑制作用增強(qiáng)。

IBDV病毒基因組為dsRNA，編碼VP1、VP2、VP3、VP4、VP5共5種蛋白，除VP1由B片段編碼外，余者均由A片段編碼。其中VP2、VP3是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，構(gòu)成病毒衣殼的主要成分。VP2具有一個(gè)構(gòu)象依賴性(不連續(xù))的中和抗原決定簇，其誘導(dǎo)的中和抗體能被動(dòng)地保護(hù)宿主不受IBDV感染(變異株和超強(qiáng)毒株除外)，故一般認(rèn)為VP2是病毒的宿主保護(hù)性抗原；VP3具有一個(gè)非構(gòu)象依賴性(連續(xù))的抗原決定簇，是病毒群特異性抗原。VP4是一種具有蛋白酶活性的病毒多肽，在病毒蛋白的成熟過程中起著重要作用。L⁵¹²A↓A⁵¹³和M⁷⁵⁵A↓A⁷⁵⁶分別對(duì)于VP2-VP4和VP4-VP3的剪切是必需的，但是VP4在翻譯中和翻譯后加工過程中會(huì)因其結(jié)構(gòu)和拓?fù)鋵W(xué)變化而行使功能。基因組A節(jié)段中大ORF上游并與之部分重疊的另外小ORF?A編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(NP)，即VP5蛋白。VP1是RNA依賴RNA聚合酶(RdRp)，與病毒dsRNA復(fù)制有關(guān)，同時(shí)還具有鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶和甲基轉(zhuǎn)移酶活性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2基因編碼蛋白永生化細(xì)胞制備方法。

它的步驟如下：

1)自傳染性法氏囊病毒浙江分離株(NB)的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)適應(yīng)毒中用蛋白酶K消化法抽提病毒dsRNA，長(zhǎng)距離一步法RT-PCR擴(kuò)增病毒全長(zhǎng)cDNA，并以此為模板PCR擴(kuò)增不同編碼蛋白的基因片段與哺乳動(dòng)物細(xì)胞真核表達(dá)pCI-neo構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pCI-neo-A、pCI-neo-VP243、pCI-neo-VP5、pCI-neo-VP3、pCI-neo-VP2、pCI-neo-VP2(CΔ60)、pCI-neo-VP2(CΔ25)、pCI-neo-VP2(CΔ18)、pCI-neo-VP2(CΔ11)和pCI-neo-VP1，經(jīng)42℃熱擊轉(zhuǎn)化CaCl₂法制備的大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞；

2)用Luria-Bertani?Medium作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，各培養(yǎng)1-3ml濃度為1-1.5OD₆₀₀值的含目的基因重組質(zhì)粒的菌液，通過超純質(zhì)粒純化試劑盒制備無內(nèi)毒素的超純質(zhì)粒；

3)用含10-15％小牛血清的Minimum?Essential?Medium作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，各重組質(zhì)粒經(jīng)Opti-MEM稀釋后在Lipofectamine?2000介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染90-95％融合的生長(zhǎng)活力旺盛的單層Vero細(xì)胞；

4)在含500μg/ml濃度G418的Minimum?Essential?Medium培養(yǎng)基中，通過極限稀釋法獲得單克隆化細(xì)胞；

5)單克隆化細(xì)胞經(jīng)PCR、RT-PCR、Southern?blot、Northern?blot和IFA/IPMA檢測(cè)后，獲得含有目的基因的永生化細(xì)胞。

本發(fā)明制備的表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2基因編碼蛋白永生化細(xì)胞，容易培養(yǎng)，增殖快速，可無限擴(kuò)大，性質(zhì)穩(wěn)定，易保存，研究方便。方法技術(shù)成熟，重復(fù)性強(qiáng)，一般研究人員就可完成。

附圖說明

圖1是傳染性法氏囊病毒基因組及編碼蛋白的物理圖譜；

圖2是真核細(xì)胞表達(dá)載體pCI-neo的質(zhì)粒圖譜；

圖3是IBDV?A片段編碼基因的PCR擴(kuò)增電泳圖；

圖4是IBDV系列VP2截?cái)囿w克隆化細(xì)胞的RT-PCR電泳圖；