[發(fā)明專利]表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2基因編碼蛋白永生化細(xì)胞制備方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710084568.6
• 申請(qǐng)日: 2005-03-08
• 公開（公告）號(hào): CN101139589A
• 公開（公告）日: 2008-03-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周繼勇;葉菊秀;陳慶新;鄭肖娟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/09
• 分類號(hào): C12N15/09;C12N15/33;C12N15/85;C12N5/10;C12N15/86;A61K39/12
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 張法高

1.一種表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2基因編碼蛋白永生化細(xì)胞制備方法，其特征在于它的步驟如下：

1)自傳染性法氏囊病毒抽提病毒RNA，長(zhǎng)距離一步法RT-PCR擴(kuò)增病毒全長(zhǎng)cDNA，并以此為模板PCR擴(kuò)增VP2基因片段與哺乳動(dòng)物細(xì)胞真核表達(dá)pCI-neo構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pCI-neo-VP2，經(jīng)42℃熱擊轉(zhuǎn)化CaCl₂法制備的大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞；

2)用Luria-Bertani?Medium作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，各培養(yǎng)1-3ml濃度為1-1.5?OD₆₀₀值的含目的基因重組質(zhì)粒的菌液，通過超純質(zhì)粒純化試劑盒制備無內(nèi)毒素的超純質(zhì)粒；

3)用含10-15％小牛血清的Minimum?Essential?Medium作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，各重組質(zhì)粒經(jīng)Opti-MEM稀釋后在Lipofectamine?2000介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染90-95％融合的生長(zhǎng)活力旺盛的單層Vero細(xì)胞；

4)在含500μg/ml濃度G418的Minimum?Essential?Medium培養(yǎng)基中，通過極限稀釋法獲得單克隆化細(xì)胞；

5)單克隆化細(xì)胞經(jīng)PCR、RT-PCR、Southern?blot、Northern?blot和IFA/IPMA檢測(cè)后，獲得含有目的基因的永生化細(xì)胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2基因編碼蛋白永生化細(xì)胞制備方法，其特征在于所述的VP2基因與含有CMV啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體pCI-neo組建成表達(dá)載體pCI-neo-VP2。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2基因編碼蛋白永生化細(xì)胞制備方法，其特征在于所述的pCI-neo-VP2重組質(zhì)粒，經(jīng)42℃熱擊轉(zhuǎn)化CaCl₂法制備的大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞后，構(gòu)建含上述表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2基因編碼蛋白永生化細(xì)胞制備方法，其特征在于所述的含目的基因的大腸桿菌經(jīng)過質(zhì)粒超純純化后，在Lipofectamine?2000介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)活力旺盛的單層Vero細(xì)胞，相應(yīng)的傳染性法氏囊病毒基因編碼蛋白的以獨(dú)立形式沉積在細(xì)胞內(nèi)。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2基因編碼蛋白永生化細(xì)胞制備方法，其特征在于所述的含目的基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行G418抗性篩選，獲得G418抗性的細(xì)胞。

6.根據(jù)權(quán)利4或5要求所述的一種表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2基因編碼蛋白永生化細(xì)胞制備方法，其特征在于所述的G418抗性的細(xì)胞，通過極限稀釋法獲得單克隆化細(xì)胞。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2基因編碼蛋白永生化細(xì)胞制備方法，其特征在于所述的單克隆化細(xì)胞，在含500μg/ml濃度G418的Minimum?Essential?Medium培養(yǎng)基中傳代、擴(kuò)繁，經(jīng)過PCR、RT-PCR、Southernblot、Northern?blot和IFA/IPMA檢測(cè)后，獲得含有目的基因的單克隆永生化細(xì)胞。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2基因編碼蛋白永生化細(xì)胞制備方法，其特征在于所述的獲得含有目的基因的單克隆永生化細(xì)胞為研究傳染性法氏囊病毒基因編碼蛋白對(duì)宿主細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控提供載體，以及表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2基因編碼蛋白應(yīng)用于傳染性法氏囊病的免疫接種。