[發明專利]一種篩選活性組分或物質的方法及依其制得的活性組分

無效

• 申請號: 200710078244.1
• 申請日: 2007-02-26
• 公開（公告）號: CN101070556A
• 公開（公告）日: 2007-11-14
• 發明（設計）人: 周紅;和生琦;董燕;鄭江
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學
• 主分類號: C12Q1/18
• 分類號: C12Q1/18;C12Q1/25;A61K36/718;A61P31/04
• 代理公司: 重慶志合專利事務所
• 代理人: 胡榮琿

1.一種結合生物傳感器技術和分離技術、從天然藥物或天然藥物提取物中篩選、分離具有與PBP2a結合活性的活性組分或活性單體化合物的方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)將PBP2a直接包被于生物傳感器的羧基化樣品池或生物素化的PBP2a包被于親和素化樣品池作為固定相配基，使PBP2a結構上發揮重要生物學作用的C末端外露并游離，以此作為天然藥物中活性物質與固定相發生結合作用的靶點；

(2)以待篩選的天然藥物提取物溶液為作為流動相，利用上述生物傳感器使其與上述固定相配基作用，篩選能夠與PBP2a發生結合作用的天然藥物或天然藥物提取物；

(3)將篩選出的與PBP2a具有較強結合活性的天然藥物提取物，經柱層析法和/或高效液相色譜法進行分離純化，對所得到的不同純化組分再通過生物傳感器進行至少一次結合活性的檢測，得到能與PBP2a發生結合的活性組分或單體化合物。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述PBP2a由MRSA來源的DNA經常規基因工程方法將其在大腸桿菌中表達后分離純化制得。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶點為耐藥性金黃色葡萄球菌PBP2a的第27～668位氨基酸或第327～668位氨基酸。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，PBP2a生物素化的步驟采用生物素化試劑BAC-SulfoNHS，通過與可溶性PBP2a片段上的游離氨基端形成穩定的酰胺鍵完成。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述PBP2a的包被包括以下步驟：

(1)以PBST反復清洗樣品池，至基線平衡；

(2)向樣品池PBST中加入親和素；

(3)PBST反復清洗，加入生物素標記的PBP2a；

(4)PBST清洗2-5次后，采集數據曲線3～l0min，計算包被值。

6.根據權利要求l所述的方法，其特征在于，所述天然藥物提取物為水提取物和/或有機溶劑提取物；所述柱層析法為離子交換柱層析或硅膠柱層析；所述高效液相色譜法為反相高效液相色譜法或正向高效液相色譜法。

7.一種能與PBP2a發生結合作用的活性組分，其特征在于，其采用權利要求1至6中任一項所述方法從天然藥物中篩選、分離得到。

8.根據權利要求7所述的活性組分，其特征在于，所述天然藥物為黃連，該組分通過以下步驟制備：

(1)黃連根或須提取液經過與PBP2a的結合、解離反應后，分別再用親合反應液反復沖洗，經鹽酸溶液洗脫、再生后，將回吸收的再生反應液pH調為中性，冷凍抽干；

(2)應用生物傳感器的回收功能，通過洗脫，得到各梯度洗脫組分，對這些組分進行PBP2a結合測定，取與PBP2a結合力最高的組分；

(3)將上述所得與PBP2a結合力最高的組分提取液pH值調至3.0～5.0，靜置后取上清液過離子樹脂，收集濾過峰、雙蒸水洗脫峰和氨洗脫峰，濃縮，低溫冷凍抽干；

(4)分別取適量上述提取物凍干粉末，以生物傳感器檢測各組分與PBP2a的結合力，取結合力最高的氨洗脫峰對應的提取液；

(5)上述氨洗脫峰提取液靜置后離心棄沉淀，上清液調整pH值為6.0～6.5，靜置后離心，合并兩次上清液，上清液上硅膠柱，以不同濃度的氯仿和乙醇洗脫，并分別收集洗脫液A、B、C，濃縮，低溫冷凍抽干；

(6)分別取適量上述洗脫液A、B、C的凍干粉末，測定其與PBP2a的結合力，取結合力最高的C組分；

(7)將上述與PBP2a結合力最高的C組分進行高效液相色譜分離，色譜條件：色譜柱柱溫25℃，流速15ml/min，進樣濃度200mg/ml，檢測波長275nm，分別收集流出峰，負壓抽干；

(8)以生物傳感器測定上述各流出峰與PBP2a的結合，與PBP2a結合力最大的95.0～100.0min流出峰所對應的組分即為活性組分HL2。