[發(fā)明專利]一種篩選活性組分或物質(zhì)的方法及依其制得的活性組分無效
| 申請?zhí)枺?/td> | 200710078244.1 | 申請日： | 2007-02-26 |
| 公開（公告）號： | CN101070556A | 公開（公告）日： | 2007-11-14 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 周紅;和生琦;董燕;鄭江 | 申請（專利權(quán)）人： | 中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué) |
| 主分類號： | C12Q1/18 | 分類號： | C12Q1/18;C12Q1/25;A61K36/718;A61P31/04 |
| 代理公司： | 重慶志合專利事務(wù)所 | 代理人： | 胡榮琿 |
| 地址： | 400038重*** | 國省代碼： | 重慶;85 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 篩選 活性 組分 物質(zhì) 方法 | ||
1.一種結(jié)合生物傳感器技術(shù)和分離技術(shù)、從天然藥物或天然藥物提取物中篩選、分離具有與PBP2a結(jié)合活性的活性組分或活性單體化合物的方法，其特征在于包括以下步驟：
(1)將PBP2a直接包被于生物傳感器的羧基化樣品池或生物素化的PBP2a包被于親和素化樣品池作為固定相配基，使PBP2a結(jié)構(gòu)上發(fā)揮重要生物學(xué)作用的C末端外露并游離，以此作為天然藥物中活性物質(zhì)與固定相發(fā)生結(jié)合作用的靶點(diǎn)；
(2)以待篩選的天然藥物提取物溶液為作為流動相，利用上述生物傳感器使其與上述固定相配基作用，篩選能夠與PBP2a發(fā)生結(jié)合作用的天然藥物或天然藥物提取物；
(3)將篩選出的與PBP2a具有較強(qiáng)結(jié)合活性的天然藥物提取物，經(jīng)柱層析法和/或高效液相色譜法進(jìn)行分離純化，對所得到的不同純化組分再通過生物傳感器進(jìn)行至少一次結(jié)合活性的檢測，得到能與PBP2a發(fā)生結(jié)合的活性組分或單體化合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述PBP2a由MRSA來源的DNA經(jīng)常規(guī)基因工程方法將其在大腸桿菌中表達(dá)后分離純化制得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶點(diǎn)為耐藥性金黃色葡萄球菌PBP2a的第27～668位氨基酸或第327～668位氨基酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，PBP2a生物素化的步驟采用生物素化試劑BAC-SulfoNHS，通過與可溶性PBP2a片段上的游離氨基端形成穩(wěn)定的酰胺鍵完成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述PBP2a的包被包括以下步驟：
(1)以PBST反復(fù)清洗樣品池，至基線平衡；
(2)向樣品池PBST中加入親和素；
(3)PBST反復(fù)清洗，加入生物素標(biāo)記的PBP2a；
(4)PBST清洗2-5次后，采集數(shù)據(jù)曲線3～l0min，計(jì)算包被值。
6.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述天然藥物提取物為水提取物和/或有機(jī)溶劑提取物；所述柱層析法為離子交換柱層析或硅膠柱層析；所述高效液相色譜法為反相高效液相色譜法或正向高效液相色譜法。
7.一種能與PBP2a發(fā)生結(jié)合作用的活性組分，其特征在于，其采用權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述方法從天然藥物中篩選、分離得到。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的活性組分，其特征在于，所述天然藥物為黃連，該組分通過以下步驟制備：
(1)黃連根或須提取液經(jīng)過與PBP2a的結(jié)合、解離反應(yīng)后，分別再用親合反應(yīng)液反復(fù)沖洗，經(jīng)鹽酸溶液洗脫、再生后，將回吸收的再生反應(yīng)液pH調(diào)為中性，冷凍抽干；
(2)應(yīng)用生物傳感器的回收功能，通過洗脫，得到各梯度洗脫組分，對這些組分進(jìn)行PBP2a結(jié)合測定，取與PBP2a結(jié)合力最高的組分；
(3)將上述所得與PBP2a結(jié)合力最高的組分提取液pH值調(diào)至3.0～5.0，靜置后取上清液過離子樹脂，收集濾過峰、雙蒸水洗脫峰和氨洗脫峰，濃縮，低溫冷凍抽干；
(4)分別取適量上述提取物凍干粉末，以生物傳感器檢測各組分與PBP2a的結(jié)合力，取結(jié)合力最高的氨洗脫峰對應(yīng)的提取液；
(5)上述氨洗脫峰提取液靜置后離心棄沉淀，上清液調(diào)整pH值為6.0～6.5，靜置后離心，合并兩次上清液，上清液上硅膠柱，以不同濃度的氯仿和乙醇洗脫，并分別收集洗脫液A、B、C，濃縮，低溫冷凍抽干；
(6)分別取適量上述洗脫液A、B、C的凍干粉末，測定其與PBP2a的結(jié)合力，取結(jié)合力最高的C組分；
(7)將上述與PBP2a結(jié)合力最高的C組分進(jìn)行高效液相色譜分離，色譜條件：色譜柱柱溫25℃，流速15ml/min，進(jìn)樣濃度200mg/ml，檢測波長275nm，分別收集流出峰，負(fù)壓抽干；
(8)以生物傳感器測定上述各流出峰與PBP2a的結(jié)合，與PBP2a結(jié)合力最大的95.0～100.0min流出峰所對應(yīng)的組分即為活性組分HL2。
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