[發明專利]一種淡水魚類肝吸蟲快速免疫檢測試劑盒和檢測方法

有效

• 申請號: 200710076976.7
• 申請日: 2007-09-11
• 公開（公告）號: CN101387641A
• 公開（公告）日: 2009-03-18
• 發明（設計）人: 胡紹良;饒樂
• 申請（專利權）人: 深圳市康百得生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/535
• 代理公司: 深圳市君勝知識產權代理事務所
• 代理人: 劉文求

1.一種淡水魚類肝吸蟲快速免疫檢測試劑盒，其盒體內設置酶聯反 應板、酶結合物、洗滌液、底物液、顯色劑、稀釋液、終止液；其特征在 于，所述酶聯反應板為從肝吸蟲中提取可溶性抗原并純化，然后包被所述 可溶性抗原制得的酶聯反應板；所述酶結合物為辣根過氧化酶標記抗魚免 疫球蛋白的酶結合物，所述可溶性抗原為可溶于水的肝吸蟲成蟲的抗原， 分步通過辛酸法和DEAE52離子層析柱層析純化制得精制所述可溶性抗 原；

所述酶聯反應板是在通用聚苯乙烯微孔板上包被可溶性抗原，然后在 室溫靜置12～24小時之后，采用0.1％～5％卵清蛋白或牛血清白蛋白封閉 2小時，然后冷凍真空干燥后裝袋封口制成；其中，所述可溶性抗原是從感 染動物中獲取肝吸蟲成蟲，并提取得到其可溶性抗原；包被液為含0.01％～ 1％可溶性抗原的緩沖液，所述緩沖液是0.01mol/L～0.15mol/L的磷酸鹽、 硼酸鹽或碳酸鹽緩沖液，pH7.5～pH9.5；

所述酶結合物為采用純化的魚免疫球蛋白免疫動物，分離出抗魚免疫 球蛋白，經純化后采用辣根過氧化酶進行免疫標記制成；

對淡水魚免疫球蛋白的制備純化鑒定標記包括步驟：

首先，采用鹽析法初級提取魚血清中的球蛋白；其次，采用層析法進 一步純化提取其免疫球蛋白；對純化物進行分析鑒定，包括測定蛋白含量 和進行電泳分析；.抗魚免疫球蛋白抗體的制備：用純化的魚免疫球蛋白免 疫動物；分離純化抗魚免疫球蛋白；酶免疫標記，采用改良過碘酸鈉法進 行辣根過氧化物酶標記，然后分離純化并進行鑒定；改良過碘酸鈉法，是 取5mgHRP溶于0.2mol/L?pH5.6的乙酸緩沖液0.5ml，再加入0.1mol/L0.25ml 的過碘酸鈉混勻，加入抗魚免疫球蛋白抗體約5mg混勻，調pH為9.0，4 ℃過夜，加入硼氫化鈉0.5mg混勻，透析過夜，在以上溶液中緩慢加入等 體積的飽和硫酸銨溶液，混勻，4℃30min，離心，去上清，沉淀以少許 0.02mol/L?pH7.4PBS液溶解，裝入透析袋，以同樣液體在4℃透析除鹽過 夜；次日取出離心，以除去不溶物，即得酶-抗體結合物，以0.02mol/L?pH7.4 PBS液加至5ml；效價測定合格后，加入等量優質甘油，分裝小瓶，低溫保 存；

所述酶結合物是含0.05％～1％的辣根過氧化物酶標記抗魚免疫球蛋白 的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.0；并且添加含量足以抑制細菌生長的防 腐劑，所述防腐劑是0.01％～0.1％的硫柳汞；

所述的試劑盒還包括陰性對照品和陽性對照品；

所述洗滌液為包含有0.1％～1％表面活性劑的0.01mol/L～0.5m0l/L磷 酸鹽緩沖液，pH6～8；底物液為0.1％～0.5％過氧化氫溶液；顯色劑為 3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺；稀釋液為0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.0；終止液 為1mol/L～2mol/L的硫酸或氫氧化鈉。

2.一種用于非診斷目的的用于權利要求1所述的試劑盒的檢測方 法，其包括步驟：

A1、酶聯反應板每孔分別加稀釋液1滴，加入待檢的樣本50ul，混 勻；其中，所述稀釋液為0.01mol/L～0.5mol/L磷酸鹽緩沖液，pH6～8；

設置陰性孔、陽性孔及空白對照孔，陰性孔、陽性孔分別加稀釋液 1滴，然后分別加入陰性對照品、陽性對照品各50ul，空白對照孔加入 稀釋液2滴；

A2、充分反應后甩去孔內液體，每孔加洗滌液1滴后立即注滿純凈 水，靜置30秒后甩去，再用純凈水洗滌至少一次，甩去，拍干；其中， 所述洗滌液為包含有0.1％～1％表面活性劑的0.01mol/L～0.5mol/L磷酸 鹽緩沖液，pH6～8；

A3、每孔加酶結合物2滴，充分反應后甩去孔內液體，每孔加洗滌 液1滴后立即注滿純凈水，靜置30秒后甩去，再用純凈水洗滌至少一次， 甩去，拍干；

A4、加底物液和顯色劑各1滴，混勻，充分顯色反應后加終止液1 滴，混勻，終止反應；其中，所述底物液為0.1％～0.5％過氧化氫溶液； 所述顯色劑為3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺；所述終止液為1mol/L～2mol/L 的硫酸或氫氧化鈉。

3.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述充分反應為 37℃避光反應30分鐘，所述充分顯色反應為37℃避光反應10分鐘。