[發明專利]一種微生物混合發酵生產纖維素酶的方法

無效

• 申請號: 200710074961.7
• 申請日: 2007-06-14
• 公開（公告）號: CN101100660A
• 公開（公告）日: 2008-01-09
• 發明（設計）人: 鄒水洋;吳清林;鄧韻;王尚武
• 申請（專利權）人: 東莞理工學院
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N1/14
• 代理公司: 深圳市順天達專利商標代理有限公司
• 代理人: 蔣海燕

技術領域

本發明屬于微生物工程技術領域，具體涉及一種微生物混合發酵生產纖維素酶的方法。

背景技術

纖維素酶是協同作用將纖維素催化水解最終產生葡萄糖的一組酶的總稱，它們在工農業許多領域有廣泛的應用。如纖維素酶可將秸稈、蔗渣等工農業廢棄物生物轉化生成葡萄糖，再經其它微生物進一步轉化生產酒精、乳酸、單細胞蛋白等生物化工產品；利用纖維素酶做飼料添加劑可提高飼料的利用率；纖維素酶還可用于廢紙脫墨、織物拋光等諸多方面。在植物生物技術的研究工作中，也經常應用纖維素酶來水解細胞壁以便進行基因工程和細胞工程等操作。所以纖維素酶被譽為打開植物寶庫的金鑰匙。

目前，用于生產纖維素酶的微生物菌種較多的是絲狀真菌，其中酶活力較強的菌種為木霉屬、曲霉屬和青霉屬，特別是綠色木霉及其近緣菌株等較為典型，是目前公認的較好的纖維素酶生產菌。一些厭氧微生物，如瘤胃細菌和熱纖梭菌等能分泌高活性的纖維素酶，但厭氧微生物生長緩慢，酶產量很低。

一般認為纖維素酶主要包括三類酶組分：內切纖維素酶(EG，EC?3.2.1.4)、外切纖維素酶(CBH，EC?3.2.1.91)、β-萄萄糖苷酶(BGL，EC?3.2.1.21)。這三種組分的協同作用對徹底水解纖維素非常重要。生產高活性纖維素酶的關鍵是選育高產菌株。目前工業用纖維素酶的來源主要是好氧絲狀真菌木霉，如里氏木霉(Trichoderma?reesei)、綠色木霉(Trichoderma?viride)、康寧木霉(Trichoderma?koningii)等產生的，其生產應用中常見的問題主要有兩個：一是現有的生產技術產酶活力還有待提高；二是木霉生產的纖維素酶系組成不完全，往往β-萄萄糖苷酶比較缺乏，這些都會嚴重影響到酶解效率。

提高纖維素酶活力以及改善酶系組成的研究現在非常活躍，提出的方法很多，其中混合發酵就是一種較為簡單有效的方法。將纖維素酶產生菌與某些其它微生物進行混菌配伍培養可以形成某種偏利的微生態關系，促進酶的分泌；還可以發揮不同微生物互補的產酶特性，從而使纖維素酶系組成較完全。據已有的研究和文獻報道，主要是木霉與黑曲霉、海棗曲霉的混合培養能提高β-葡萄糖苷酶活力，但對其它兩種酶活力的影響不大；另外，木霉與某些酵母菌混合培養也能少量提高纖維素酶活力。針對以上不足，本發明提出了一種新的混合發酵方法。

發明內容

本發明要解決的主要技術問題是克服已有技術的不足，提供一種微生物混合發酵生產高活性纖維素酶的方法。即以康寧木霉(Trichoderma?koningii)與米根霉(Rhizopus?oryzae)為纖維素酶生產菌，接種孢子液或二級種子液于固態或液態培養基中，通過控制培養基的組成、混菌培養過程中康寧木霉與米根霉的生物量以及其它培養條件，生產高活性的纖維素酶。

為實現本發明的目的，本發明采用以下技術方案：

本發明提供的微生物混合發酵生產纖維素酶的方法有固態發酵工藝和液態發酵工藝，其步驟分別如下：

1、微生物混合液態發酵生產纖維素酶的工藝步驟

(1)液體制種：選擇康寧木霉和米根霉為生產菌株，分別經斜面試管培養、搖瓶擴大培養(或發酵罐再擴大培養)制備所需二級液體菌種；

(2)先將康寧木霉的二級液體菌種，按液態發酵培養基體積的3～9％接種于液態發酵培養基，20～35℃下通氣培養24～72小時后，再接種3～9％體積的米根霉二級液體菌種，20～35℃下繼續通氣培養48～96小時，將發酵培養液過濾，過濾液即為原酶液；

(3)將上述過濾液濃縮至原來體積的2/10～3/10可制成高活性液態纖維素酶制劑，濃縮液經噴霧干燥可制成粉狀高活性纖維素酶制劑。

2、微生物混合固態發酵生產纖維素酶的工藝步驟

(1)液體制種：選擇康寧木霉和米根霉為生產菌株，分別經斜面試管培養、搖瓶擴大培養(或發酵罐再擴大培養)制備所需二級液體菌種；

(2)將康寧木霉和米根霉的斜面菌種制成孢子懇浮液，每毫升孢子數為10⁷～10⁸個，以2～10∶1的體積比例混合，按同態發酵培養基重量的6～14％接種；或將康寧木霉和米根霉的二級液體菌種，以2～10∶1的體積比例混合，按固態發酵培養基重量的6～14％接種，在25～35℃、空氣相對濕度70～90％下發酵培養72～144小時，30～48小時翻曲一次，即成固體酶曲；

(3)將發酵培養的固體酶曲按1∶8～10的重量比加水浸泡1～2小時后過濾，過濾液即為纖維素酶的提取液；