[發(fā)明專利]同時(shí)檢測(cè)乙型肝炎病毒基因亞型和耐藥突變的試劑盒及方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710073933.3
• 申請(qǐng)日: 2007-04-06
• 公開（公告）號(hào): CN101092651A
• 公開（公告）日: 2007-12-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 田潔;任維;向筑;廖生赟;鄒耀東
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 深圳市博銳專利事務(wù)所
• 代理人: 張明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及病毒亞型和耐藥突變檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種同時(shí)檢測(cè)乙型肝炎病毒基因亞型和耐藥突變的試劑盒及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球大約有3.5億人攜帶了乙肝病毒，亞洲攜帶的人大約是2.2億。我國(guó)是最主要的乙肝大國(guó)，2002年我國(guó)流行病學(xué)調(diào)查顯示，乙肝表面抗原陽(yáng)性率9.09％，約1.2億，慢性乙型病毒性肝炎病人約3000萬(wàn)。目前這類人群正處在發(fā)病和治療的高峰時(shí)期。HBV感染呈世界性流行，其基因型分布具有地域性特點(diǎn)，在我國(guó)和亞洲以B、C型為主，有少量的D型。目前許多研究結(jié)果都表明不同基因亞型的HBV病毒對(duì)藥物的敏感不同與疾病進(jìn)程的關(guān)系也不相同。例如，一些研究表明基因型C較B更容易引起嚴(yán)重的肝炎或肝癌，對(duì)干擾素的應(yīng)答率A型高于D型，B型高于C型。因此對(duì)感染的HBV進(jìn)行基因分型具有重要的臨床意義。核苷類似物是當(dāng)前公認(rèn)的抗HBV藥物，我國(guó)目前使用最多的是拉米夫定和阿德福韋酯。這些藥物對(duì)多數(shù)乙型肝炎病人無(wú)法徹底清除體內(nèi)的HBV，患者需要長(zhǎng)期維持治療，隨著這些藥物的廣泛、長(zhǎng)期應(yīng)用，HBV在宿主體內(nèi)感染以及抗病毒治療的過程中會(huì)發(fā)生變異，并在宿主體內(nèi)免疫系統(tǒng)的壓力下以及在治療干預(yù)過程中進(jìn)行變異的優(yōu)勢(shì)選擇，以達(dá)到逃逸免疫、對(duì)抗藥物作用、實(shí)現(xiàn)物種生存的目的，隨之出現(xiàn)病毒基因變異耐藥的問題，病毒基因組序列分析對(duì)于發(fā)現(xiàn)基因型耐藥非常重要，通常耐藥變異是某種特定的變異，這種變異株在抗病毒治療前很少存在。乙肝病毒一旦出現(xiàn)變異耐藥后肝功能惡化的比例顯著增高，甚至快速進(jìn)展至肝衰竭。

中國(guó)專利200410025199.X和200510065445.9分別公開了一種檢測(cè)拉米夫定耐藥HBV?DNA的方法，但利用該方法不能在測(cè)定耐藥性的同時(shí)檢測(cè)出HBV基因亞型。乙肝患者在治療期間，臨床醫(yī)師需要掌握感染的乙肝病毒是哪種基因亞型，對(duì)抗病毒藥物治療的反應(yīng)性差異，是否存在拉米夫定和阿德福韋酯耐藥突變。這對(duì)指導(dǎo)患者選用何種抗病毒藥、是否繼續(xù)使用該抗病毒藥、何時(shí)停用或換用何種抗病毒藥都有很現(xiàn)實(shí)的臨床意義，對(duì)病人抗病毒治療的療效判斷、預(yù)后評(píng)估十分重要。至今為止國(guó)內(nèi)外未見同時(shí)檢測(cè)HBV基因分型和兩種常用藥耐藥的產(chǎn)品和報(bào)道，因此臨床上如果需要獲得全面的參考信息，病人需要做多項(xiàng)檢測(cè)，大大加重了病人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種乙型肝炎病毒基因亞型和耐藥突變檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種同時(shí)檢測(cè)乙型肝炎病毒基因亞型和耐藥突變的試劑盒，所述試劑盒包括：

1)特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，其堿基序列如SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2所示；

2)乙型肝炎病毒基因亞型特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ?ID?NO：3、SEQ?ID?NO：4和SEQ?ID?NO：5所示；

3)乙型肝炎病毒耐藥突變特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ?ID?NO：6、SEQ?ID?NO：7、SEQ?ID?NO：8、SEQ?ID?NO：9、SEQ?IDNO：10、SEQ?ID?NO：11、SEQ?ID?NO：12、SEQ?ID?NO：13、SEQ?ID?NO：14、SEQ?ID?NO：15、SEQ?ID?NO：16和SEQ?ID?NO：17所示；

上述所有序列可由其堿基互補(bǔ)序列替換。

所述寡核苷酸探針固定在基質(zhì)上。

所述寡核苷酸探針固定在尼龍膜上。

所述引物標(biāo)記生物素。

一種同時(shí)檢測(cè)乙型肝炎病毒基因亞型和耐藥突變的方法，包括以下步驟：

1)制備血清，提取乙型肝炎病毒DNA；

2)以步驟1)所得乙型肝炎病毒DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒基因或轉(zhuǎn)錄本的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

3)上述PCR產(chǎn)物與固定在基質(zhì)上的權(quán)利要求1所述全部探針序列雜交；

4)洗膜及顯色。

所述PCR擴(kuò)增體系為：?10×buffer????2.5μL

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dNTPs?????50μM

TaqE??????2.5U