[發明專利]一種高增殖力、高細胞毒活性CIK細胞的制備方法

無效

• 申請號: 200710072095.8
• 申請日: 2007-04-25
• 公開（公告）號: CN101063108A
• 公開（公告）日: 2007-10-31
• 發明（設計）人: 王志華;秦莉
• 申請（專利權）人: 哈爾濱醫科大學
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06;C12N5/08
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所
• 代理人: 單軍

技術領域

本發明涉及一種細胞的制備方法。

背景技術

細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine?induced?killer?cells，CIK細胞)，是將人外周血、臍血或骨髓的單個核細胞在體外用細胞因子培養一段時間后獲得的一群異質細胞。由于該種細胞同時表達CD3和CD56兩種膜蛋白分子，故又被稱為NK細胞樣T淋巴細胞，兼具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性和NK細胞的非主要組織相容性復合物(major?histocompatibility?complex，MHC)限制性殺瘤優點。但是現有的CIK細胞增殖力差、細胞毒活性低。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有的CIK細胞增殖力差、細胞毒活性低的問題，而提供的一種高增殖力、高細胞毒活性CIK細胞的制備方法。

高增殖力、高細胞毒活性CIK細胞按以下步驟制備：將單個核細胞用含10％胎牛血清的RPMI?1640培養基懸浮2h，之后加入基因重組人細胞因子IFN-γ，使懸浮液中IFN-γ的濃度為1000U/mL，繼續培養24h后加入CD3單抗體蛋白及基因重組人細胞因子IL-2、IL-12和IL-1，使培養液中CD3單抗體蛋白的濃度為100ng/mL、細胞因子IL-2的濃度為600U/mL、細胞因子IL-12的濃度為5ng/mL、細胞因子IL-1的濃度為100U/mL，然后再在37℃、CO₂濃度為5％、濕度為100％的環境中繼續培養7～24天，即得到高增殖力、高細胞毒活性CIK細胞；其中加入CD3單抗體蛋白和基因重組人細胞因子IL-2、IL-12和IL-1后每隔3天半量換液，并補加IL-2和IL-12以保持培養液中的濃度不變；加入CD3單抗體蛋白和基因重組人細胞因子IL-2、IL-12和IL-1后第6天再補加CD3單抗體蛋白，使培養液中CD3單抗體蛋白的濃度達到100ng/mL。

本發明采用基因重組人細胞因子IL-2和IL-12聯合誘導CIK細胞，細胞因子的聯合應用可以對淋巴細胞的擴增產生協同作用，比使用單一細胞因子誘導細胞的擴增倍數提高了約1倍，并且減少了因大劑量單因子應用所產生的毒副作用。本發明制備出的CIK細胞的細胞毒活性明顯高于現有CIK細胞50％以上，而且細胞毒活性可維持2～3周，CIK細胞最高殺傷率出現在培養的第13～15天。

附圖說明

圖1是具體實施方式二中經基因重組人細胞因子IL-2誘導培養21天的(第一組)CIK細胞CD3⁺CD56⁺表型檢測結果圖；圖2是具體實施方式二中經基因重組人細胞因子IL-2和基因重組人細胞因子IL-12誘導培養21天的(第二組)CIK細胞CD3⁺CD56⁺表型檢測結果圖；圖3是具體實施方式二中經基因重組人細胞因子IL-12誘導培養21天的(第三組)CIK細胞CD3⁺CD56⁺表型檢測結果圖；圖4是具體實施方式二中經基因重組人細胞因子IL-2和基因重組人細胞因子IL-12誘導培養3天的(第二組)CIK細胞擴增集落形態光學顯微鏡觀察圖；圖5是具體實施方式二中經基因重組人細胞因子IL-2和基因重組人細胞因子IL-12誘導培養6天的(第二組)CIK細胞擴增集落形態光學顯微鏡觀察圖；圖6是具體實施方式二中經基因重組人細胞因子IL-2誘導培養10天的(第一組)CIK細胞擴增集落形態光學顯微鏡觀察圖；圖7是具體實施方式二中經基因重組人細胞因子IL-12誘導培養10天的(第三組)CIK細胞擴增集落形態光學顯微鏡觀察圖；圖8是具體實施方式二中經基因重組人細胞因子IL-2和基因重組人細胞因子IL-12誘導培養10天的(第二組)CIK細胞擴增集落形態光學顯微鏡觀察圖；圖9是具體實施方式二中三組CIK細胞增殖曲線圖，曲線A為第一組細胞增殖曲線，曲線B為第二組細胞增殖曲線，曲線C為第三組細胞增殖曲線。

具體實施方式