[發明專利]CIK細胞的凍存及復蘇

有效

• 申請號: 200710072094.3
• 申請日: 2007-04-25
• 公開（公告）號: CN101063107A
• 公開（公告）日: 2007-10-31
• 發明（設計）人: 王志華;袁玉濤
• 申請（專利權）人: 哈爾濱醫科大學
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06;C12N5/08
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所
• 代理人: 榮玲

技術領域

本發明涉及凍存技術的一種新的應用。

背景技術

CIK細胞是一種非MHC限制性的高效溶腫瘤細胞毒性T淋巴細胞，其在外周血淋巴細胞中的比例為1％～5％。1991年Schmidt-Wolf等首先報道了一類由多種細胞因子誘導的殺傷細胞，即CIK(cytokine-induced?killer?CIK)細胞。正常人或患者外周血、骨髓單個核細胞中加入細胞因子IFN-γ、IL-1、CD3mAb、IL-2經2～4周的誘導即可獲得大量的腫瘤殺傷細胞CIK(《世界華人消化雜志》.2007.15(6)：548～553)，CIK細胞是非MHC限制性的一群異質性細胞，具有強大的殺瘤活性。具有TIL、LAK細胞無法比擬的優勢，但誘導CIK細胞需要花費很長的時間，在臨床應用上需要多次誘導和采血，給患者造成了極大的痛苦和不必要的麻煩。

發明內容

本發明的目的是為了解決CIK細胞誘導時間長，需要多次誘導和患者多次采血的問題，而首次提出了CIK細胞的凍存及復蘇。CIK細胞的凍存及復蘇通過以下步驟實現：一、CIK細胞的凍存：a、取CIK細胞放入離心管中，然后以1000轉/分鐘的速度離心5分鐘，取出上清液放于玻璃瓶中并于零下20度凍存，視上清液完全凍結后，將裝有上清液的玻璃瓶放于零下80度的低溫冰箱中凍存備用，b、向離心管內的細胞中加入細胞凍存液，細胞凍存液是由AIMW和DMSO按照9∶1的體積比配制，然后將離心管內物質放于凍存管中，c、按照溫度下降速度為10攝氏度/小時的速率將凍存管在4℃的溫度下放置1小時后，再于零下20℃放置2小時，然后放入零下80℃冰箱過夜，最后放于液氮中凍存，即達到凍存CIK細胞的目的。二、CIK細胞的復蘇：d、取出步驟一a中凍存的上清液于4度冰箱中解凍，然后將上清液在2000轉/分鐘的條件下離心5分鐘，取上清液備用，得到經過離心處理的上清液，e、將凍存的CIK細胞放入37～40℃的溫水中速融，然后將CIK細胞加入到裝有生理鹽水的離心管中并以1000轉/分鐘的速度離心5分鐘，然后去上清液，f、將CIK細胞放入到步驟二d中經過離心處理的上清液中，然后將細胞濃度稀釋到1.0×10⁶/ml后均分于六孔板中培養，根據每孔中細胞的體積按600U/ml和100ng/ml的濃度加IL-2和CD3mAb，于孵箱中培養，即達到CIK細胞復蘇的目的。本發明中復蘇的細胞存活率為95～99％，利用凍存技術保存了CIK細胞并使它的殺傷活性和增殖率得到保持，CIK細胞凍存后可以根據需要隨時復蘇，復蘇時間僅需要1～2天，避免了臨床使用CIK細胞需要多次誘導的麻煩和多次采血給患者造成的痛苦，節省了每次誘導所需要的大量的誘導因子和培養液，降低了成本，利用本發明可長期保存CIK細胞并且在長期保存后CIK細胞殺傷活性不發生變化。

附圖說明

圖1是用熒光倒置顯微鏡觀察的復蘇后的CIK細胞400倍放大圖，圖2是未凍存的CIK細胞的400倍放大圖；圖3和圖4是CIK細胞凍存后復蘇測定細胞表型圖，圖3中橫軸為CD4⁺，縱軸為CD8⁺，圖4中橫軸為CD3⁺，縱軸為CD56⁺；圖5是復蘇后的CIK細胞未凍存的CIK細胞的增殖率的比較圖，圖5中深色線為未凍存的CIK細胞的增殖率，淺色線為復蘇的CIK細胞的增殖率。

具體實施方式