[發明專利]一種增強抗菌肽在植物體內表達的豐度和穩定性的方法

無效

• 申請號: 200710071592.6
• 申請日: 2007-09-30
• 公開（公告）號: CN101397559A
• 公開（公告）日: 2009-04-01
• 發明（設計）人: 劉仁虎;陳錦清;汪小福;陳笑蕓;王伏林;劉智宏;郎春秀
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N15/62;C12N15/82
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司
• 代理人: 尉偉敏

技術領域

本發明涉及一種在植物體串連融合表達抗菌肽以提高抗菌肽表達豐度和穩定性的技術，用于增強農作物抗病性。

背景技術

抗菌肽是生物體防御系統中產生的一類對外源病菌具有高效殺滅活性的肽類物質，特別是一些動物來源的抗菌肽，如天蠶素(Cecropins)、蜂毒素(Melittins)、蛙皮素(Magainins)等，對細菌、真菌、病毒、螺旋體等多種病原菌甚至癌細胞都有一定的殺滅活性，而且長期使用不會使病原菌產生耐藥性，也不存在殘留污染問題，是抗生素和化學殺菌劑的理想替代品。

由于抗菌肽具有高效、環保、不使病源菌產生耐藥性等優點，近年來，已成為植物抗病基因工程、養殖飼料添加劑、新興醫藥等領域的研究熱點。特別是在植物抗病基因工程領域，抗菌肽基因資源成為最有潛力和應用價值的資源之一。然而，動物源抗菌肽基因轉入植物后所遇到的主要問題就是抗菌肽表達豐度偏低，限制了抗菌肽功效的發揮。雖然基因的轉錄后表達很復雜，與多種因素有關，但這種動物源抗菌肽在植物細胞表達偏低的現象普遍認為主要是外源抗菌肽在植物細胞不夠穩定，容易被細胞內的蛋白酶降解的原因。

1997年，Tailor等發現鳳仙花(Impatiens?balsamina?L.)種子天然抗菌肽的前體蛋白是由引導肽和連續6個長度為20個氨基酸的成熟肽單元串聯融合組成，各成熟肽單元之間由保守的蛋白酶剪切位點隔開，前體蛋白翻譯后可在胞間溶膠中自動剪切為各成熟抗菌肽單元。為了驗證該剪切位點是否可以應用于其它植物和其它抗菌肽，Francois等將由該剪切位點隔開的大麗花抗菌肽和蘿卜抗菌肽在擬南芥中融合表達，結果證明該鳳仙花抗菌肽剪切位點完全可以在擬南芥中發揮作用，大麗花抗菌肽和蘿卜抗菌肽的融合蛋白被徹底切割為有功能活性的2個抗菌肽。與其它類型的蛋白質剪切位點相比，識別該位點的內肽酶天然存在于植細胞胞間溶膠，前體蛋白切割完全，切割后成熟肽兩端殘留的剪切位點的氨基酸少，對成熟肽的功能影響小。本發明利用了該內肽酶識別位點，以Thanatin抗菌肽為例，設計了可自動剪切的抗菌肽基因多拷貝串聯融合表達技術，并結合其它外源蛋白增強表達技術，以增強抗菌肽在植物體內的表達豐度和穩定性，提高作物抗病效果。

發明內容

本發明提供了一種增強抗菌肽在植物體內表達的豐度和穩定性的方法，解決了異源抗菌肽在植物體內表達豐度偏低，易被植物內源蛋白酶降解的問題。

本發明的具體技術方案如下：一種通過多拷貝串聯融合表達的原理來增強抗菌肽在植物體內的表達豐度和穩定性的方法，包含以下步驟：A)以特征序列為MASERQALMLILLTTFFFTIKPSQA的大豆幾定質酶信號肽為引導肽，引導目標蛋白定向積累于細胞壁和細胞間隙；B)以特征序列為SNAADEVATPEDVEPG的多肽為連接肽，連接多個抗菌肽串聯融合表達，表達后于S↓NAADEVATPE↓DVEPG位點剪切為多個抗菌肽單元；C)根據目標植物密碼子使用頻率對編碼序列進行優化；D)將引導肽、抗菌肽、連接肽組合成引導肽+抗菌肽+(連接肽+抗菌肽)*N的結構形式將抗菌肽串聯融合表達，提高抗菌肽表達效率和穩定性，N為任意拷貝數。

上述的多拷貝抗菌肽融合表達載體構建方法，包含以下步驟：A)在引導肽+抗菌肽的融合基因末端設計Bgl?II+終止密碼+Xba?I或其它切點，克隆構建Destination?Vector，B)在連接肽+抗菌肽的融合基因頭部加BamH?I切點，尾部加Bgl?II+終止密碼+Xba?I或其它切點(同A步驟的末端設計)，克隆構建EntryVector；C)將Entry?Vector的目標序列用BamH?I和Xba?I切下，連接于Destination?Vector用Bgl?II和Xba?I酶切產生的載體臂，以所得新的載體為Destination?Vector將Entry?Vector目標片段反復連接進入Destination?Vector，直至獲得所需抗菌肽基因拷貝數。