[發明專利]一種重組類人膠原蛋白及生物合成方法

無效

• 申請號: 200710070660.7
• 申請日: 2007-09-11
• 公開（公告）號: CN101148479A
• 公開（公告）日: 2008-03-26
• 發明（設計）人: 姚菊明;杜春玲
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K14/78;C12N15/62
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司
• 代理人: 唐銀益

1.一種重組類人膠原蛋白，其特征在于：該重組類人膠原蛋白由膠原區和非膠原區組成。

2.根據權利要求1所述的重組類人膠原蛋白，其特征在于：所述非膠原區位于膠原區的羧基端。

3.根據權利要求1或2所述的重組類人膠原蛋白，其特征在于：所述的非膠原區的氨基酸序列源于T4噬菌體次要纖維蛋白。

4.根據權利要求1或2所述的重組類人膠原蛋白，其特征在于：膠原區由SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列組成。

5.根據權利要求1或2所述的重組類人膠原蛋白，其特征在于：非膠原區由SEQ?ID?NO：3所示的氨基酸序列組成。

6.根據權利要求1或2所述的重組類人膠原蛋白，其特征在于：該重組類人膠原蛋白具有如下所示的氨基酸序列：[Gly-Pro-Arg-Gly-Asp-Asn-Gly-Pro-Ala-Gly-Ser-Val-Gly-Pro-Thr-Gly-Asp-Thr-Gly-Pro-Glu-Gly-Phe-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-His-Gly-Glu-Ala-Gly-Ala-Ser]_n-Gly-Tyr-Ile-Pro-Glu-Ala-Pro-Arg-Asp-Gly-Gln-Ala-Tyr-Val-Arg-Lys-Asp-Gly-Glu-Trp-Val-Leu-Leu-Ser-Thr-Phe-Leu-Ala-Ser。

7.根據權利要求6所述的重組類人膠原蛋白，其特征在于：該序列中n＝1～16。

8.根據權利要求7所述的重組類人膠原蛋白，其特征在于：該序列中n＝8。

9.一種如權利要求1所述的重組類人膠原蛋白的生物合成方法，其特征在于：

(1)分別設計與膠原區和非膠原區氨基酸序列相對應的DNA序列，DNA序列的兩端分別為Spe?I和Nhe?I限制性內切酶位點；

(2)利用化學合成的方法分別得到膠原區和非膠原區的核苷酸序列，經退火處理分別成為與膠原區和非膠原區氨基酸序列相對應的雙螺旋目的DNA單體；

(3)膠原區的目的DNA單體通過在質粒中的Spe?I和Nhe?I限制性內切酶位點的重復聚合連接而成為重復膠原區的高分子DNA；

(4)非膠原區的目的DNA單體通過在質粒中的Spe?I和Nhe?I限制性內切酶位點連接到重復膠原區的高分子DNA上；

(5)將含有重復膠原區DNA和非膠原區DNA的高分子DNA克隆到表達載體，并轉入到表達用大腸桿菌宿主細胞，通過誘導劑誘導蛋白質表達；

(6)利用金屬螯合親和層析對表達所得蛋白進行純化，得到具有良好熱穩定型的重組類人膠原蛋白。

10.根據權利要求7所述的重組類人膠原蛋白的生物合成方法，其特征在于：步驟(2)所述的膠原區和非膠原區核苷酸序列為：

膠原區(Col)-1：

5’-ACTAGTGGCCCGCGTGGTGATAACGGTCCGGCAGGCAGCGTTGGTCCAACCGGCGATACTGGTCCAGAAGGTTTCCGGGGCGACAGCGGTCCGCATGGTGAAGCAGGCGCTAGC-3’

膠原區(Col)-2：

5’-GCTAGCGCCTGCTTCACCATGCGGACCGCTGTCGCCCCGGAAACCTTCTGGACCAGTATCACCGGTTGGACCAACGCTGCCTGCCGGACCGTTATCACCACGCGGGCCACTAGT-3’

非膠原區(Fol)-1：

5’-ACTAGTGGCTATATCCCGGAAGCACCGCGTGATGGTCAGGCATATGTTCGTAAAGATGGTGAATGGGTTCTGCTGAGCACCTTCTTGGCTAGC-3’

非膠原區(Fol)-2：

5’-GCTAGCCAAGAAGGTGCTCAGCAGAACCCATTCACCATCTTTACGAACATATGCCTGACCATCACGCGGTGCTTCCGGGATATAGCCACTAGT-3’。