[發明專利]一種重組類人膠原蛋白及生物合成方法

無效

• 申請號: 200710070660.7
• 申請日: 2007-09-11
• 公開（公告）號: CN101148479A
• 公開（公告）日: 2008-03-26
• 發明（設計）人: 姚菊明;杜春玲
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K14/78;C12N15/62
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司
• 代理人: 唐銀益

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種有高熱穩定性的重組類人膠原蛋白及其生物合成方法。

背景技術

膠原蛋白在哺乳動物機體中含量十分豐富，它是細胞外基質中的一種纖維狀蛋白，對動物和人體皮膚、血管、筋腱和軟骨的形成都十分重要，并為這些結締組織提供一定的結構和機械力學性質。另一方面，膠原蛋白具有良好的細胞粘附性能，與細胞結合對細胞的生長，分化及遷移有一定的積極作用。此外，對血小板凝聚等也具有一定的作用。鑒于膠原蛋白固有的生物相容性、生物降解性和吸收性以及促進細胞形成等諸多功能，在生物醫用材料、組織工程、化妝品和食品等領域具有廣泛的應用價值。在分子結構上，膠原蛋白是由平行線型鏈組成，每一線型鏈由三條扭曲左旋的聚肽鏈通過鏈間氫鍵緊密結合而形成一極強的右旋三重螺旋結構。而膠原肽鏈的一級結構多為Gly-Xaa-Yaa的三聯體，它富含甘氨酸和脯氨酸殘基；另外，還含有較多的不由DNA堿基密碼子編碼的羥脯氨酸，它是在蛋白質一級結構序列形成之后由特定的酶——脯氨酸-4-羥化酶(P4H)作用于序列中的脯氨酸形成的，羥脯氨酸羥基通過分子間氫鍵對穩定膠原螺旋結構、提高熱穩定性起著重要的作用。對于膠原蛋白而言，真正可發揮其生物功能的必須是由三條纏繞的直鏈組成，成為螺旋構造，若三條螺旋直鏈立體結構遭到加工或受高熱而破壞，則成為一般俗稱的明膠。因此，膠原蛋白的熱穩定性對其發揮生物功能具有相當重要的作用。

目前確認的膠原蛋白已有20多種，其中以I型膠原蛋白的含量最多，約占全部膠原蛋白的90％以上。膠原蛋白多半從牛筋和牛皮等動物組織中萃取，但隨著禽流感、瘋牛病及其人類變種——“克雅氏癥”(Creutzfeldt-jakobdisease)等的出現，人們開始擔心動物來源的膠原蛋白及其衍生物可能會受到病毒污染，并且伴隨潛在的免疫排異反應。為了降低膠原蛋白的免疫排異反應，科學家設想從人胎盤中獲取膠原蛋白，但是該研究受到世界人權組織及FDA的阻止。然而，現代生物技術的發展為利用DNA重組技術生產類人膠原蛋白提供了可能，一方面可以提高蛋白的純度、降低從動物體內萃取時受到病毒感染的風險，同時，通過嚴密的分子設計可選擇性地保留膠原蛋白的優點，提高其活性和力學性能。這就要求在了解膠原蛋白的結構特征，以及結構和性能之間的關系的基礎上，設計與合成新的膠原蛋白來取代天然膠原蛋白不足。隨著現代生物技術的發展，國內外陸續有公司或研究單位開始開發重組類膠原蛋白的生產技術。例如，美國FibroGen公司已成功表達包括I型膠原在內的9種不同類型的重組膠原蛋白；Cohesion?Technologies，Inc.也利用轉基因的方法，培育出含類人膠原蛋白的小白鼠；美國膠原公司將特定的乳腺表達系統微量注射到受精卵母細胞后，移植到哺乳動物母體，使其懷胎足月，得到含有重組類人膠原奶汁的哺乳動物。但通過哺乳類或昆蟲細胞株生產的成本極高、生產周期長，而且昆蟲細胞和部分哺乳動物中沒有足夠水平的P4H。研究人員也嘗試利用微生物(如大腸桿菌E.coli)來生產類人膠原蛋白，因為該方法的生產成本相對較低。但在大多數的大腸桿菌和酵母中其自身根本不能合成P4H，因而不能形成Hyp殘基。所以，用這些方法得到的重組膠原蛋白嚴格地說只是明膠，因為其內部并沒有形成天然膠原所特有的三重螺旋結構，其理化性質和生物活性也因而受到很大的影響。

發明內容

本發明的目的是提供一種在羥脯氨酸缺失的情況下，利用基因重組技術和生物工程的手段，在膠原區序列引入一段源于T4噬菌體次要纖維蛋白(Fibritin)的非膠原區序列，然后利用大腸桿菌進行蛋白質的表達，從而獲得一種具有較高熱穩定性的重組類人膠原蛋白及其生物合成方法。

本發明的一種具有較高熱穩定性的重組類人膠原蛋白由膠原區和非膠原區組成；非膠原區位于膠原區的羧基端。

膠原區的氨基酸序列主體為Gly-Pro-Arg，Gly-Asp-Asn，Gly-Pro-Ala，Gly-Ser-Val，Gly-Asp-Thr，Gly-Phe-Arg，Gly-Asp-Ser，Gly-Pro-Thr，Gly-Asp-Thr，Gly-Pro-Glu，Gly-Pro-His，Gly-Glu-Ala三聯體。

非膠原區的氨基酸序列源于T4噬菌體次要纖維蛋白(Fibritin)，該區的氨基酸序列包含SEQ?ID?NO：1所示的序列。

所述的膠原區由SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列組成。

所述的非膠原區由SEQ?ID?NO：3所示的氨基酸序列組成。