[發明專利]九孔鮑NF－κB抗體的制備及其檢測方法

無效

• 申請號: 200710070419.4
• 申請日: 2007-08-03
• 公開（公告）號: CN101205254A
• 公開（公告）日: 2008-06-25
• 發明（設計）人: 吳信忠;姜玉聲;吳劉記
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;G01N33/53
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司
• 代理人: 陳禎祥

技術領域

本發明屬于無脊椎動物中貝類的免疫因子抗體的制備及其檢測方法。

背景技術

核轉錄因子-κB(Nuclear?factor-kappa?B，NF-κB)是重要的免疫因子，它是具有幾個成員的家族。20世紀后期，Sen和Baltimore從B淋巴細胞核抽提物中首次發現該因子，起初它被認為是一種能與免疫球蛋白κ鏈基因增強子特異結合，并能促進κ鏈基因表達的球蛋白((SenR?and?Baltimore?D.Inducibility?of?kappa?immunoglobulin?enhancer-binding?protein?NF-κB?by?aposttranslational?mechanism.Cell?1986；46：705-716.)。此后的20多年中，NF-κB及其介導的信號通路得到了廣泛而深入地研究。大量研究發現NF-κB能與細胞因子、粘附因子等基因啟動子或增強子部位的κB位點發生特異性結合，進而參與調控這些基因的轉錄，在機體的免疫應答、炎癥反應、細胞凋亡和生長發育方面發揮著重要的作用(Ghosh?S，May?MJ，KoppEB.NF-κB?and?Rel?proteins：evolutionarily?conserved?mediators?of?immune?responses.Annu.Rev.Immunol.1998；16：225-260)。貝類在無脊椎動物中占有重要地位，貝類養殖已躍居整個水產養殖業的第一位，九孔鮑是我國南方海水養殖的重要經濟貝類。隨著大規模養殖的興起，病害成為阻礙貝類養殖的主要因素之一，但目前還沒有針對貝病的有效控制途徑。如何利用現代免疫生物技術防治貝類病害將成為保障鮑安全養殖、穩定發展的關鍵因素，而對其宿主分子免疫機理的研究是研究新型免疫生物抗病技術的基礎。利用核轉錄因子-κB的生物學特性，結合現代分子生物學技術研究九孔鮑分子免疫機理將有利于從病原與宿主雙方面入手，開創有效的防治貝病的新思路和新技術。本申請人曾申請過申請號為200510061771.2，名稱為《九孔鮑免疫因子特異抗體的制備及其檢測方法》。該申請沒有充分公開九孔鮑NF-κB基因的全長序列以及九孔鮑NF-κB兩個結構域的引物具體序列等內容，因而難以實現制備九孔鮑免疫因子抗體的目的。

發明內容

本發明針對上述專利申請文件的缺陷，充分公開相關內容，以達到制備九孔鮑免疫因子特異抗體及其檢測方法的目的。

眾所周知，NF-κB家族的蛋白的N端通常具有一個同源區(RHD)，通常大小在300個氨基酸左右，該區域是與DNA結合形成聚合物的功能區；而位于C端的轉錄激活域(transactivation?domain，TD)具有轉錄激活功能，該區域在NF-κB家族各成員之間的保守性較低。本專利申請發明人首次克隆九孔鮑NF-κB轉錄因子(Ab-Rel)的cDNA的核苷酸全序列與預測編碼的氨基酸序列，如SEQNO1、NO2所示，并且首先發現，Ab-Rel也具有RHD和TD兩個功能結構區。其中，RHD是位于在N末端第91-377個氨基酸殘基之間，TD是位于在C末端第383-584個氨基酸殘基之間(詳見SEQNO1)。

本發明的主要內容是按申請人克隆出的九孔鮑NF-κB基因全序列，設計了擴增九孔鮑NF-κB轉錄因子(Ab-Rel)N末端RHD(在78-368個氨基酸殘基間)和C末端TD(在383-520個氨基酸殘基間)片段的寡聚核苷酸引物，獲得了RHD和TD兩個重組表達的蛋白，將純化重組蛋白作為抗原，制備了RHD和TD兩個多克隆抗體，并建立了間接夾心酶聯免疫反應試驗(ELISA)和蛋白雜交(Western?blotting)的方法，來檢測該NF-κB因子的RHD和TD在不同時段和不同環境作用下蛋白水平的變化，進而提供一種對養殖貝類，特別是九孔鮑NF-κB因子的檢測技術。