[發明專利]螺旋藻工廠化培植優良品系的篩選方法

無效

• 申請號: 200710069961.8
• 申請日: 2007-07-09
• 公開（公告）號: CN101240242A
• 公開（公告）日: 2008-08-13
• 發明（設計）人: 汪志平;黃暉;楊靈勇;曹學成
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N1/12
• 分類號: C12N1/12
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司
• 代理人: 陳禎祥

技術領域

本發明屬于篩選優質螺旋藻的技術。

背景技術

螺旋藻(Spirulina)，是一種光合放氧、呈規則螺旋的原核絲狀微藻，系藍藻門(Cyanophyta)、顫藻目(Oscillatoriales)、顫藻科(Oscillatoriaceae)的一個屬[武漢植物學研究，1997，15(4)：369-374]。因富含優質蛋白和多種生物活性物質而受到國內外的極大關注，并已在大量研究的基礎上形成了龐大的螺旋藻產業，成為目前全球研究開發規模最大，應用前景最廣泛的經濟微藻。值得指出的是，眾多的實驗研究與長期的生產實踐表明，螺旋藻不同品種(系)，對溫度、光質、光照強度，以及培養液的鹽度、pH和營養成分等環境因子的要求與適應性存在顯著差異，由此產生的經濟效益也相差甚遠[水生生物學報，1999，23(1)：59-64]。因此，與其它農業與生物技術產業一樣，選育品性兼優的品種(系)是有效提升當前螺旋藻產業經濟效益、切實解決生產實際問題，最直接而重要的途徑之。

目前國內外篩選適合大規模生產螺旋藻品種(系)的一般常規方法如下：1、對新分離到的品種(系)進行編號；2、在實驗室條件下作多種環境因子的交叉組合培養試驗，并根據所測定的生長曲線、光合放氧、生化組成等指標作初步篩選；3、對實驗室初篩到有生產養殖潛力的候選品種(系)在不同季節、氣候及營養條件下進行養殖小試、中試與生產性試驗，再篩選出目標品種(系)。這一方法雖然實用、有效，但程序繁瑣、工作量大、周期長、成本高。因此，有必要建立簡單、快速、有效的評價與篩選方法，以滿足當前國內外螺旋藻產業不斷發展的實際需要。

發明內容

本發明目的是提供一種簡單、快速、有效、低成本的篩選適合大規模生產的優質螺旋藻品系的新方法。

藻藍蛋白連接多肽I為藍藻等少數藻類所特有，在藻膽體的組裝過程中起著至關重要的作用(Yu?et?al.，1982；Mac?Coll，1998)，。我們通過設計特定引物，利用PCR等分子生物學技術克隆并測定了7株螺旋藻品系Sp-1、Sp-2、Sp-3、Sp-4、Sp-5、Sp-6和Sp-7的相應基因序列，并利用DNAStar?v6.13軟件將該基因翻譯成氨基酸后進行多重序列聯配。依據相似性程度，7株品系可以分為兩大類：即Sp-1、Sp-2和Sp-6為一類；Sp-3、Sp-4、Sp-5和Sp-7為另一類。在這兩大類品系中，同一大類內部品系間序列基本相同，而在不同大類品系間差異主要表現在1～80位氨基酸序列的第7、20、30、56、72位點。經過長期大量的實驗研究與生產實踐表明，Sp-3、Sp-4、Sp-5和Sp-7這4株品系在實際生產養殖中表現優良，而Sp-1、Sp-2和Sp-6因適應能力差而不用于工廠化生產養殖。研究證明，螺旋藻的藻藍蛋白連接多肽I氨基酸序列特征與生產性狀存在相關性，其第1～80位氨基酸序列可用作優質螺旋藻品系篩選的分子標記。即候選品系的第1～80位氨基酸序列的第7、20、30、56、72位點若與Sp-3、Sp-4、Sp-5和Sp-7的相同，則生產性狀優良，可應用于大規模生產；若與Sp-1、Sp-2和Sp-6的一致，則生產性狀差，不用于工廠化生產。

本發明的顯著優點：

本發明所建的篩選適合大規模生產的優質螺旋藻品系的方法與常規方法相比，不僅簡單、快速、有效，而且成本低，并適合大規模、高通量篩選。

具體實施方式

本發明的詳細技術方案可以通過以下步驟實施：

1、選用材料為公知的7株螺旋藻品系，即Sp-1、Sp-2、Sp-3、Sp-4、Sp-5、Sp-6和Sp-7(浙江大學原子核農業科學研究所生物資源與分子工程實驗室也有保存)。其中，Sp-3、Sp-4、Sp-5和Sp-7對環境適應能力強，在大規模生產養殖中被廣泛應用，而Sp-1、Sp-2和Sp-6因適應能力差而不用于工廠化生產。

2、試劑和儀器

Taq?DNA聚合酶和瓊脂糖為上海生工生物工程公司產品；克隆載體pMD18-T、dNTP、DNA限制性內切酶、T4?DNA連接酶、RNase?A均為日本TaKaRa公司產品；DNA凝膠回收試劑盒購于Invitrogen公司；PCR引物由上海英駿公司合成。其它試劑均為分析純。序列擴增用美國Hybaid公司的Thermal?Cycler?PCR儀，測序用美國ABI公司的3730型測序儀。

3、PCR引物設計與擴增