[發(fā)明專利]一種三磷酸胞苷的晶膠吸附層析分離方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710069817.4
• 申請(qǐng)日: 2007-06-29
• 公開（公告）號(hào): CN101085798A
• 公開（公告）日: 2007-12-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 沈紹傳;贠軍賢;姚克儉;王良華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C07H19/10
• 分類號(hào): C07H19/10;C07H1/06
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 黃美娟;袁木棋

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種三磷酸胞苷的晶膠吸附層析分離方法，尤其是一種利用超大孔連續(xù)床晶膠層析技術(shù)(Supermacroporous?Cryoge1Chromatography，簡(jiǎn)稱晶膠層析)從微生物發(fā)酵液中分離三磷酸胞苷(CTP)的方法。

(二)背景技術(shù)

CTP是機(jī)體內(nèi)的高能磷酸化合物，參與RNA、磷脂的生物合成與代謝，其二鈉鹽在臨床上廣泛用于改善脂肪代謝、促進(jìn)神經(jīng)組織修復(fù)、軟化血管等的治療，對(duì)神經(jīng)官能癥、高膽固醇、腦震蕩、脂肪肝等疾病有顯著療效。

CTP可通過光合磷酸化法轉(zhuǎn)化、微生物(如酵母)發(fā)酵或化學(xué)合成等方式進(jìn)行制備。目前，以胞嘧啶核苷一磷酸(CMP)為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)CTP，是工業(yè)上廣泛采用的方法。其主要工藝過程包括培養(yǎng)發(fā)酵、菌體過濾、雜蛋白沉淀、陽(yáng)離子交換脫鹽、乙醇沉淀、過濾、陰離子交換樹脂吸附、活性炭脫色、精制干燥等多個(gè)步驟，工藝過程復(fù)雜，過程成本高。在工業(yè)生產(chǎn)中，陰離子交換樹脂吸附CTP時(shí)達(dá)到吸附平衡需要的時(shí)間很長(zhǎng)，使得料液吸附層析柱內(nèi)停留的時(shí)間常常長(zhǎng)達(dá)數(shù)天至十多天，環(huán)境溫度較高時(shí)(如高于25～30℃的夏季)，料液很容易變質(zhì)，導(dǎo)致生產(chǎn)操作無法順利進(jìn)行，嚴(yán)重影響了生產(chǎn)效率和CTP產(chǎn)品的質(zhì)量。簡(jiǎn)化分離工藝，提高分離效率，降低分離過程成本，是CTP制備生產(chǎn)中需要解決的難題。

(三)發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有CTP分離純化技術(shù)中的上述不足，本發(fā)明提供了一種迅速高效地分離CTP的新方法。

為達(dá)到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種三磷酸胞苷的晶膠吸附層析分離方法，所述方法如下：(1)將含有三磷酸胞苷的混合液調(diào)pH為酸性，以0.1～30cm/min流速上超大孔連續(xù)床晶膠介質(zhì)床柱，進(jìn)行吸附；所述晶膠介質(zhì)為陰離子交換晶膠介質(zhì)，所述陰離子交換晶膠介質(zhì)的孔徑為5～400μm、孔隙率為50～98％、功能基團(tuán)為胺基或其衍生基團(tuán)；(2)以去離子水或pH值1～6的稀酸溶液為沖洗液沖洗床柱，除去晶膠介質(zhì)內(nèi)殘留的混合液；(3)用洗脫液進(jìn)行洗脫，收集含三磷酸腺苷的洗脫峰，得到所述的三磷酸腺苷，所述的洗脫液為含有0.001～3M堿金屬鹽的稀酸溶液。

陰離子交換超大孔晶膠介質(zhì)的制備可通過結(jié)晶致孔、聚合反應(yīng)和孔內(nèi)接枝方法實(shí)現(xiàn)。首先，將聚合物單體、交聯(lián)劑、催化劑的水溶液裝入層析柱(如常規(guī)層析玻璃柱)，在冷凍條件下進(jìn)行結(jié)晶致孔，得到超大孔晶膠基質(zhì)。然后，將帶有陰離子交換功能基團(tuán)的接枝單體溶液注入晶膠基質(zhì)，在催化劑作用下進(jìn)行孔內(nèi)接枝聚合反應(yīng)，得到陰離子交換超大孔連續(xù)床晶膠介質(zhì)。晶膠基質(zhì)的制備方法可參照文獻(xiàn)中介紹的方法(Yao?et?al.，Chem.Eng.Sci.61，6701-6708，2006)；基質(zhì)孔內(nèi)接枝聚合反應(yīng)也可參照文獻(xiàn)(Savina?et?al.，J.Chromatogr.A?1092，199-205，2005)。具體過程見后面的實(shí)例。

所述胺基或其衍生基團(tuán)優(yōu)選為叔胺或季胺型陰離子交換晶膠介質(zhì)。

所述胺基或其衍生基團(tuán)優(yōu)選為下列之一：①-N⁺(CH₃)₃、②-N(CH₃)₂、③-N(C₂H₅)₂。

所述步驟(2)中沖洗液流速0.1～20cm/min。

所述步驟(3)中的洗脫為梯度洗脫，洗脫液流速0.1～20cm/min，步驟如下：先用含堿金屬鹽0.001～0.06M、pH?1～6的稀酸溶液I進(jìn)行洗脫，再用含堿金屬鹽0.1～3M、pH?1～6的稀酸溶液II進(jìn)行洗脫，收集含三磷酸胞苷的洗脫峰，得到所述的三磷酸胞苷。

所述稀酸溶液、稀酸溶液I、稀酸溶液II各自獨(dú)立為下列之一：①鹽酸溶液、②硫酸溶液、③乙酸溶液、④檸檬酸溶液。

所述堿金屬鹽優(yōu)選為NaCl或KCl。

所述步驟(1)中含有三磷酸胞苷的混合液為酵母發(fā)酵液。

具體的，所述方法如下：

(1)將含有三磷酸胞苷的酵母發(fā)酵液調(diào)pH為2～3，以2～10cm/min流速上超大孔連續(xù)床晶膠介質(zhì)床柱，進(jìn)行吸附；所述晶膠介質(zhì)為陰離子交換晶膠介質(zhì)，所述陰離子交換晶膠介質(zhì)的孔徑為5～400μm、孔隙率為50～98％、功能基團(tuán)為下列之一：①-N⁺(CH₃)₃、②-N(CH₃)₂、③-N(C₂H₅)₂；