[發明專利]一種前T載體及其制備與應用

無效

• 申請號: 200710069815.5
• 申請日: 2007-06-29
• 公開（公告）號: CN101333538A
• 公開（公告）日: 2008-12-31
• 發明（設計）人: 林陳水;于真真;許明;任慧穎;楊丹燕
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司
• 代理人: 黃美娟;袁木棋

(一)技術領域

本發明涉及一種可用于快速克隆PCR產物的前T載體及其制備與應用。?

(二)背景技術

PCR技術是分子生物學和基因工程研究中的一項基本技術，它被廣泛用于體外擴增已知或未知的特異DNA片段。對PCR產物進行快速有效的克隆是開展雜交分析、高質量測序及從復雜PCR產物中分離目的片段等下游實驗，實現PCR產物多種用途的必經之路。T-載體是近年發展起來的一種用于直接克隆PCR產物的新型載體。T-載體一般為線性，其分子末端各有一個3′dT(脫氧胸苷)突出。利用Taq?DNA聚合酶的末端轉移酶活性，在擴增DNA的3′末端非模板依賴地加上一個核苷酸，通常為脫氧腺苷酸(dA)。這個3′dA突出端被用于把PCR產物插入到插入位點有一個3′dT突出的T-載體上。這樣就將PCR產物以粘性末端連接的方式直接克隆到載體上。這種方式不僅克服了常規克隆方法的缺點，而且操作簡便、方法快捷、連接效率高，因而其應用范圍非常廣泛。?

經典的T-載體的構建方法有兩種：(1)將載體通過Sma?E或EcoR?V等平端內切酶線性化切出平端，在缺乏dATP及存在過量dTTP情況下，用Taq?DNA聚合酶催化，在3’末端加上dT，回收后即得到T-載體。該方法對反應條件要求嚴格，平末端加dT的效率達不到100％，因為反應是一個動態過程，Taq酶的工作效率隨反應體系中越來越多的T末端產生而降低，這就導致少量兩端均未加T的平端線性化質粒的存在，在與?PCR產物連接過程中難以避免載體自身環化，且經過兩次回收的過程較繁瑣；每次生產T-載體產量有限(一般為1μg)，不適于大規模生產，且dT堿基不太穩定，故批次質量不穩定，如果其貯存時間較長或多次凍融反復使用，克隆效率會大大降低。如藍白斑篩選時，即使有大量白色菌落出現，其中很多都是假陽性。這樣制作T-載體只是為維護商業利益有意回避他人復制。(2)用脫氧核苷酸末端轉移酶(TDT)在線性化載體的3’末端加上雙脫氧胸腺嘧啶核苷酸(ddTTP)。這種方法存在明顯缺點：一是同樣不能保證100％的載體分子末端都能加上dT，二是難以控制加上去的正好是1個dT。?

利用限制性內切酶制備T-載體是T-載體制備方法中最為先進的方式，國內外的一些學者都進行了嘗試，并建立了相應的T-載體。在內切酶家族中，有一類稱可變酶，它們的識別序列中的一個或幾個核苷酸是可變的。經查New?England?Biolabs公司的目錄，符合上述特征的酶列于表1：?

表1?可用于生產T-載體的限制性內切酶(NEB)?

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Restriction?EnzymeRecognition?SequenceAhd?I5′GACNNN*NNGTC3′BciVI5′GTATCCNNNNNN*3′Bmr?I5′ACTGGGNNNNN*3′Hph?I5′GGTGANNNNNNNN*3′Hpy188?I5′TCN*GA3′HpyCH4III5′CAN*GT3′