[發(fā)明專利]一種前T載體及其制備與應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710069815.5
• 申請日: 2007-06-29
• 公開（公告）號: CN101333538A
• 公開（公告）日: 2008-12-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 林陳水;于真真;許明;任慧穎;楊丹燕
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 黃美娟;袁木棋

1.一種前T載體，由以下方法制備得到：(1)以含有氨芐青霉素除外的大腸桿菌敏感的抗生素的抗性基因的質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，在引物的5’末端引入Xcm?I酶切位點，擴增得到含有所述抗生素的抗性基因及其上下游表達調(diào)控序列、兩端含有Xcm?I酶切位點的DNA片段；(2)用T4DNA連接酶將步驟(1)得到的DNA片段和T載體進行連接；(3)將步驟(2)所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α或JM109，篩選陽性克隆，即得所述前T載體。

2.制備如權(quán)利要求1所述的前T載體的方法，其特征在于所述方法如下：

(1)以含有氨芐青霉素除外的大腸桿菌敏感的抗生素的抗性基因的質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，在引物的5’末端引入Xcm?I酶切位點，擴增得到含有所述抗生素的抗性基因及其上下游表達調(diào)控序列、兩端含有Xcm?I酶切位點的DNA片段；(2)利用重疊延伸拼接技術(shù)，使用T₄DNA連接酶將步驟(1)得到的DNA片段和T載體進行連接；(3)將步驟(2)所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α或JM109，篩選陽性克隆，即得所述前T載體。

3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述含有氨芐青霉素除外的大腸桿菌敏感的抗生素的抗性基因的質(zhì)粒為下列之一：①pET28，②pET39。

4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟(1)以質(zhì)粒pET28或pET39為模板DNA進行PCR擴增，引物序列為：

P1：

5’XXXGGATCCAAGGGTATAATGGGCCTAACTACGGCTACACTA3’，

P2：

5’CTCAAGCTTCCAAGGGTATAATGGACCCCTATTTGTTTATTTTT3’，

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3分鐘，94℃變性30s，45℃退火30s，72℃延伸90s，三個循環(huán)；然后94℃變性30s，72℃延伸90s，27個循環(huán)。

5.如權(quán)利要求1所述的前T載體在制備用于快速克隆PCR產(chǎn)物的T載體中的應(yīng)用。

6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述T載體制備方法如下：抽提前T載體的DNA，用限制性內(nèi)切酶Xcm?I酶切后，0.8％～1％瓊脂糖電泳分離載體DNA片段和含有抗性基因的DNA片段，回收大片段DNA，即為所述用于快速克隆PCR產(chǎn)物的T載體。