[發明專利]基因重組畢赤酵母生產耐高溫木聚糖酶的方法

無效

• 申請號: 200710065854.8
• 申請日: 2007-04-30
• 公開（公告）號: CN101067117A
• 公開（公告）日: 2007-11-07
• 發明（設計）人: 黃遵錫;許波;唐湘華
• 申請（專利權）人: 云南師范大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N9/24;C12N15/56;C12R1/84
• 代理公司: 昆明正原專利代理有限責任公司
• 代理人: 金耀生

技術領域

本發明涉及基因重組畢赤酵母生產耐高溫木聚糖酶的方法。

背景技術

木聚糖是植物半纖維素的重要組分，主要存在于植物的細胞壁中，約占細胞干重的35％，是自然界中除纖維素外最豐富的多糖，也是一種巨大的可再生資源。但麥類(如小麥、黑麥、稻谷、麩皮、米糠等)飼料中的木聚糖作為非淀粉多糖抗營養因子對動物的消化和吸收有很強的抗營養作用。主要表現為：在動物胃腸道中與營養物質粘性結合，降低營養成分的吸收；結合消化酶和膽汁酸，影響消化，增加排糞量，粘糞增多，污染環境；導致動物胃腸道中微生物繁殖增多，并對畜禽產品品質造成不利影響。

因此，開發和利用麥類谷物和糠麩等豐富資源的最關鍵問題是消除飼料中的抗營養因子。在這些飼料中添加木聚糖酶(主要是內切-β-1，4-木聚糖酶)可以有效降解木聚糖，削弱甚至消除其抗營養作用，提高飼料的利用率，降低空氣中氨氣和硫化物的濃度，減輕污染，促進動物的健康。因此，木聚糖酶對于開發谷物、糠麩類等資源具有十分可觀的經濟價值、社會意義和生態效益。

木聚糖降解酶是水解木聚糖成為木二糖、木寡糖，以及少量阿拉伯糖和木糖的一種復雜的復合酶系統，廣泛存在于自然界的細菌和真菌中，在飼料工業中得到了極廣泛的應用?，F已成為國內外研究的熱點，并取得了很多重要進展，主要包括木聚糖酶的結構和作用機理、酶學和酶應用特性、具優良特性木聚糖酶產生菌株的篩選、通過傳統和基因工程手段改良木聚糖酶產生菌以及木聚糖在飼料工業中的應用等方面。

特別是近年來分子生物學技術飛速發展，木聚糖基因工程研究已取得了巨大進展。為了高效表達木聚糖酶和改變其特性以適應商業應用，自1983年Bernier等從Bacillus?subtilis?PAPII5中最先分離得到木聚糖酶基因至今，國外科技工作者已克隆出百余種木聚糖酶基因，并在原核生物、絲狀真菌和酵母等各種宿主菌中得到活性表達。原核表達系統中，重組木聚糖酶基因在大腸桿菌中的表達量一般要比在親本中低，即便有所提高，其表達的蛋白也難以分泌到培養基中，而是限制在細胞質或周質腔內。從有利于生產及進一步提高表達量水平的角度出發，許多科研工作者嘗試利用分泌型的芽孢桿菌、鏈霉菌、曲霉和酵母菌等作為受體菌來進行表達。目前已報道的表達系統有Streptomyces?parullus、Bacillus?subtilis、Saccharomycescerevisiae、Pichia?yeast、Kluyveromyces?lactis、T.reesei、A.niger、A.oryzae等，報道的木聚糖酶最高表達量為20000單位/毫升發酵液。

自1998年以來，分別有芬蘭國際公司、丹麥NOVO公司在我國生產并大量推廣木聚糖酶，取得了較好的效果。在此期間國內也有不少研究單位和公司開始進行這方面的研究工作，并取得了大量的研究成果，有些產品已進入市場，但目前的產品不論是國內和國外的都不具備耐熱特性。顆粒飼料的加工過程中都要經歷一個短暫的高溫制粒工藝(75-93℃)，一般的木聚糖酶在此高溫下會大幅度喪失活性，因此能在飼料中真正推廣利用的木聚糖酶必須具有良好的熱穩定性；另一方面飼料中的木聚糖酶最終的作用場所是動物正常體溫(37℃)的腸胃中，木聚糖酶同時也必須在常溫下保持較高活性。因此，如何解決在制粒高溫和在動物正常體溫下同時具有較高酶活性這一矛盾，已成為目前飼用酶制劑應用的關鍵性技術環節。

目前，通過基因工程技術對木聚糖酶基因在分子水平上進行改造將是解決這一問題的有效手段，也是今后飼用木聚糖酶發展的趨勢和關鍵。

發明內容

本發明的目的是提供一種基因重組畢赤酵母生產耐高溫木聚糖酶的方法。它是從黑曲霉(Aspergillus?niger?var?niger?strain?N402)中分離出木聚糖酶基因，成功實現木聚糖酶基因在真核表達系統畢赤酵母中的高效表達。

本發明是從黑曲霉(Aspergillus?niger?var?niger?strain?N402)中分離出木聚糖酶基因，在真核表達系統畢赤酵母中高效表達。