[發明專利]基因重組畢赤酵母生產耐高溫木聚糖酶的方法

無效

• 申請號: 200710065854.8
• 申請日: 2007-04-30
• 公開（公告）號: CN101067117A
• 公開（公告）日: 2007-11-07
• 發明（設計）人: 黃遵錫;許波;唐湘華
• 申請（專利權）人: 云南師范大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N9/24;C12N15/56;C12R1/84
• 代理公司: 昆明正原專利代理有限責任公司
• 代理人: 金耀生

1.一種基因重組畢赤酵母生產耐高溫木聚糖酶的方法，其特征在于按以下步驟進行：

1)工程菌的構建：

(1)黑曲霉基因組DNA的提取；

(2)采用PCR反應從黑曲霉基因組DNA中克隆木聚糖酶基因片斷，引物和反應條件如下：

引物1(F)：5′-cggaattcgctcctgtgccggaacctg-3′

引物2(R)：5′-cggaattcagaggagatcgtgacactggcgcg-3′

反應條件為：94℃變性1min，50℃復性1min30s，72℃延伸2min30s，30個循環后，72℃保溫20min，得黑曲霉木聚糖酶基因序列：

cggaattctggtgtcgcgaagtgctggtattaactacgtgcaaaactacaacggcaaccttggtgatttcacctat

gacgagagtgccggaacattttccatgtactgggaagatggagtgagctccgactttgtcgttggtctgggctggaccactggttcttctaagtga

gtgactgtattctttaaccaaagtctaggatctaacgttttctagcgctatcacctactctgccgaatacagtgcttctggctcctcttcctacctcgctg

tgtacggctgggtcaactatcctcaggctgaatactacatcgtcgaggattacggtgattacaacccttgcagctcggccacaagccttggtaccg

tgtactctgatggaagcacctaccaagtctgcaccgacactcgaactaacgaaccgtccatcacgggaacaagcacgttcacgcagtacttctcc

gttcgagagagcacgcgcacatctggaacggtgactgttgccaaccatttcaacttctgggcgcagcatgggttcggaaatagcgacttcaattat

caggtcatggcagtggaagcatggagcggtgctggc

(3)膠回收DNA片段：取適量PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，用小量柱離心式膠回收試劑盒進行膠回收；

(4)重組酵母表達載體的構建：將克隆得到的木聚糖酶基因片段通過EcoR?I位點與表達載體PGAP?Zalpha?A相連接，構建表達載體PGAP?Z?alpha-Xyl；

(5)畢赤酵母宿主的轉化：重組表達載體通過電穿孔法分別轉化畢赤酵母SMD1168和GS115，采用畢赤酵母電轉化程序，然后分別篩選出高效表達轉化子；

(6)酵母轉化子的搖瓶發酵培養：從平板上取少量菌接種于BMGY培養基中培養2天，再轉入BMMY培養基中誘導培養兩天，離心去除細胞得到含木聚糖酶的上清液，然后對發酵液進行酶活和酶學性質檢測；

2)采用上述構建的工程菌發酵培養生產木聚糖酶：在不同規模發酵罐中擴大培養生產木聚糖酶，培養基為每升含磷酸30ml，硫酸鈣1g，硫酸鉀18g，硫酸鎂15g，氫氧化鉀4g，甘油40g，0.0004g生物素；發酵工藝為溫度30℃，pH5.0，通風量為0.5vvm，攪拌100～500轉/分，使溶氧控制在20％以上；發酵分為兩個階段，第一階段為菌體生長階段，按5％接入種子后，種子開始在上述培養基中生長，培養時間48小時，當甘油耗盡時，溶氧會迅速上升；此時轉入第二階段，流加誘導培養基，使溶氧始終維持在20％以上，培養時間為100至200小時，微濾去除酵母細胞得到含木聚糖酶的上清液。

2、根據權利要求所述的基因重組畢赤酵母生產耐高溫木聚糖酶的方法，其特征在于所述黑曲霉基因通過基因定點技術和DNA全合成技術進行優化，優化后的基因必須編碼下列氨基酸序列：

MKVTAAFAGLLVTAFAAPVPEPVLVSRSAGINYVQNYNGNLGDFTYDESAGTFSMYWEDGVSSDFVVGLGWTTGSSNAIT

YSAEYSASGSSSYLAVYGWVNYPQAEYYIVEDYGDYNPCSSATSLGTVYSDGSTYQVCTDTRTNEPSITGTSTFTQYFSV

RESTRTSGTVTVANHFNFWAQHGFGNSDFNYQVMAVEAWSGAGSASVTISS。