[發明專利]對硝基苯－β－D－葡糖苷的合成及其應用

無效

• 申請號: 200710057848.8
• 申請日: 2007-07-05
• 公開（公告）號: CN101337982A
• 公開（公告）日: 2009-01-07
• 發明（設計）人: 孫家莉;王金良;陳麗宇
• 申請（專利權）人: 天津市醫藥科學研究所
• 主分類號: C07H15/203
• 分類號: C07H15/203;G01N21/78;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域：

本發明涉及到β-D-葡萄糖苷酶的底物對硝基苯-β-D-葡糖苷的合成方法，及用該底物測定細菌β-D-葡萄糖苷酶來鑒別白色念珠菌和都柏林菌念珠菌，并快速鑒定腸球菌的方法。

背景技術：

白色念珠菌和都柏林念珠菌都有較強的致病性。都柏林念珠菌是1995年才命名的新的致病性念珠菌。近年來，從HIV感染患者人體中分離出都柏林念珠菌，其毒力比白色念珠菌強，但在目前的臨床細菌學檢驗中，白色念珠菌和都柏林念珠菌很相似他們的芽管生成實驗及奪取膜孢子試驗均為陽性，不能將這兩種菌分開，則影響到后期用藥的針對性。再者，腸球菌為院內感染的重要病原菌，不僅可引起尿路感染、皮膚軟組織感染，還可引起危及生命的腹腔感染、敗血癥、心骨膜炎和腦膜炎，也會引起肺炎和呼吸系統等疾病。傳統的方法檢定腸球菌最快也需48-24小時，會導致病情的延誤。本發明根據酶動力學原理設計的酶法檢測，就是利用細菌內β-D-葡萄糖苷酶的檢測能夠快速地將白色念珠菌和都柏林菌區分開來，并且能夠快速鑒定腸球菌。但是β-D-葡萄糖苷酶底物對硝基苯-β-D-葡糖苷的合成未見報道。我們根據多年合成各類型酶底物的經驗，研究合成了該底物：對硝基苯-β-D-葡糖苷。

發明內容：

本發明提供了β-D-葡萄糖苷酶的底物對硝基苯-β-D-葡萄糖苷的合成方法。并提供了用該底物測定細菌β-D-葡萄糖苷酶，以便快速區分白色念珠菌和都柏林念珠菌及快速鑒定腸球菌的方法。

我們的合成方法是以D-葡萄糖為原料經醋酸酐使糖基部分乙酰化，再經溴代，然后與對硝基苯酚縮合，再用甲醇鈉水解得到。

本發明所述的對硝基苯-β-D葡糖苷的合成，是經過以下步驟制得：

——β-五乙酰葡糖的制備：以葡萄糖為原料進行乙酰化反應，取干燥的D-葡萄糖200g，無水醋酸鈉0.1-0.8倍(w/w)，醋酐5-8倍(w/v)，溫熱溶解，水浴上加熱回流并攪拌2h，攪拌下倒入5-10倍于醋酐量的冰水中，攪拌1個小時，析出大量淺色結晶，過濾，水洗結晶，干燥，制得β-五乙酰葡糖粗品，用5-8倍量95％乙醇重結晶，得到β-五乙酰葡糖結晶220g，熔點mp130-132℃；此步反應醋酐的加入量最好為葡萄糖量的6倍(g/v)以上，維持體系有效回流，以防止葡萄糖的焦化或難溶。

——溴試劑的制備：3g紅磷于20-30ml冰醋酸中，冰浴下逐漸滴入15-20g溴，完畢后放置半小時，過濾得溴試劑，密封保存于冰箱內備用。

——溴-α-D-四乙酰基葡糖的制備：50gβ-五乙酰葡糖，70-80ml溴試劑攪拌溶解，放置2小時，加入150ml氯仿混合，將混合物倒入5000ml冰水中，分出氯仿層以等體積的冰水洗兩次，再用等體積的飽和的碳酸氫鈉洗一次，取氯仿層加無水硫酸鈉攪拌后靜止過夜，次日在50-60℃水浴減壓蒸去氯仿，得一糖漿。溶于等體積的乙醚中0℃放置過夜，得40g粗品，用2倍量乙醚重結晶得35g，mp84℃。

——對硝基苯-β-D-四乙酰基葡糖苷的制備：取50g溴-α-D四乙酰基葡糖，33-41g的對硝基苯酚，于500ml丙酮中攪拌5-10分鐘使之溶解，加1mol/LNaOH液250-300ml，攪拌2-3分鐘，溶解，于冰箱放置過夜。收集長針狀結晶，用水洗至白色。以20-30倍量無水乙醇重結晶，得長針狀結晶23g，mp174-176℃。

——對硝基苯-β-D-葡糖苷的制備：取上步的對硝基苯-β-D-四乙酰基葡糖苷進行水解反應，20g對硝基苯-β-D-四乙酰基葡糖苷懸浮于200-500ml無水甲醇中，37℃保溫5-15分鐘，加入1mol/L甲醇鈉無水甲醇液10-40ml，混勻，溶解，冰箱放置過夜，收集結晶，得12g粗品。

——精制時發現，以無水乙醇重結晶時，溶液變黃、非酶水解現象較為嚴重，且晶形成團簇，改為用無水甲醇重結晶后非酶水解現象減少，且晶形為細針狀。12g粗品加20-30倍量的無水甲醇、活性炭脫色，重結晶后得白色細針狀結晶10g，真空干燥。mp164-166℃。可以大大地減少非酶水解問題，干燥采用真空干燥以避免進一步水解。

本發明所述，用上述方法制得的對硝基苯-β-D-葡糖苷在細菌學β-葡糖苷酶的檢測中的應用，是用來快速鑒別白色念珠菌和都柏林念珠菌，并鑒定腸球菌。

其步驟如下：

——材料

1.底物紙片的制作：6mm圓形濾紙片，再將濾紙片置于玻璃皿中，高溫滅菌。精密稱取4mg對硝基苯-β-D-葡糖苷溶于1ml生理鹽水中，不停攪拌，以均勻分配濾紙片上的底物，置35℃干燥待用。

2.緩沖液：不同pH磷酸鹽緩沖液(pH5.0～pH7.0)。