[發明專利]一種分離和固定化酶的免疫磁性微球的制備方法及其應用

有效

• 申請號: 200710057435.X
• 申請日: 2007-05-23
• 公開（公告）號: CN101092614A
• 公開（公告）日: 2007-12-26
• 發明（設計）人: 白鋼;余養盛;劉春琴;曹宇;楊文博
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14;C12N9/00
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司
• 代理人: 侯力

【技術領域】本發明屬于生物技術領域，涉及利用免疫磁性微球進行酶的分離純化和固定化的方法，特別是可用于分離純化L-半胱氨酸脫巰基酶的免疫磁性微球的制備及其在合成L-半胱氨酸中的應用，以提高L-半胱氨酸的轉化率。

【背景技術】傳統方法上，酶的分離純化過程較為繁瑣復雜，需經過細胞破碎、離心分離、鹽析、疏水層析、陰陽離子交換層析和凝膠過濾層析等過程，導致酶的收率較低。

酶的固定化技術已成為生物技術中非?；钴S的研究領域之一，傳統上主要是采用吸附、包埋、交聯以及共價結合等方法，均具有各自的局限性，開發新型、高效的固定化酶技術已成為這一領域的發展趨勢。

磁性微球(Magnetic?Microspheres，MMS)，或叫磁性微珠(Magnetic?Beads，MB)是近年發展起來并廣泛應用于磁性材料、生物工程以及生物醫藥等領域的一種新型多功能試劑。磁性微球是指含有磁性金屬或金屬氧化物(如Fe、Co、Ni及其氧化物)超細粉末而具有磁響應性的高分子微球。由于其超順磁性，給目標生物產品的分離帶來了革命性的發展；而且由于其在磁性環境可以快速富集，因此為實現免疫學分析分離以及靶向給藥提供了可能。由于磁性微球具備成本低廉，材質優良以及生物相容性高等諸多優點，其應用范圍已日漸廣泛。

免疫磁性分離(Immunomagnetic?separation，IMS)，是基于磁性微球發展起來的一項新技術，通過將抗體固定于磁性微球載體上，實現對目標抗原的一步分離純化，在具有高效的磁響應性能的同時，又具有親和層析的高度特異性。早期用于抗體固定化的方法主要采用物理吸附法和化學耦聯法，前者結合效率低且存在抗體泄漏的問題，后者借助于化學官能團耦聯抗體，存在隨機性，并因空間位阻的存在而降低其抗原的結合活性，這無疑影響了免疫磁性分離技術的應用研究。

【發明內容】本發明的目的是解決現有技術中存在的上述問題，為酶的分離純化和固定化技術開辟一條新的途徑，涉及利用免疫磁性微球對目的酶進行一步分離純化和固定化的技術。

本發明采用金黃色葡萄球菌蛋白A(ProteinA)作為橋聯劑將IgG抗體固定于磁性微球載體上，以生物特異性耦聯法代替了傳統的物理吸附法和化學鍵合法，所制備的免疫磁性微球可應用于一步分離純化目的酶，以及進一步固定化目的酶，進而對其底物進行連續的催化反應。

本發明具體內容包括：

一.免疫磁性微球的制備：

制備用于分離純化和固定化酶的免疫磁性微球，是將按照中國專利ZL03144274.9所述方法活化后的磁性微球與ProteinA溶液于4℃反應過夜，采用PBS緩沖液充分洗滌6～8次；再將耦聯有Protein?A的磁性微球置于NaHCO₃-NaCO₃緩沖液中與多抗血清或者單抗腹水進行吸附連接；經PBS充分洗凈后，采用二甲基庚二酸酯(DMP)進行ProteinA和IgG與磁性微球表面的交聯固定，最后加入TBS緩沖液終止反應，充分洗凈后即得到可用于目的酶的分離純化的免疫磁性微球，其抗體耦聯量為4～10mg/mL。

二.目的酶的分離純化：

將耦聯有抗目的酶抗體的免疫磁性微球與含有目的酶的細胞裂解液混合，于2～8℃振蕩反應2～12小時；然后將其置于磁珠收集器上用于吸附固定磁性微球，棄去反應液，經PBS充分洗凈后，采用甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH?1.5～3.5)于2～8℃振蕩解離吸附的目的酶；磁性分離微球，并采用PB緩沖液中和解離液，即得到純化的目的酶。所收集的免疫磁性微球經PBS洗凈后，可重復使用。

三.目的酶的固定化：

將耦聯有抗目的酶抗體的免疫磁性微球，與細胞裂解液混合，并于2～8℃振蕩反應2～12小時；然后將其置于磁珠收集器上用于吸附固定磁性微球，除去反應液，經PBS充分洗凈后，結合有目的酶的免疫磁性微球可用于催化特定的底物進行連續的酶促反應。

與傳統上分離純化酶的方法相比較，采用生物特異性耦聯法制備的免疫磁性微球用于目的酶的分離純化和固定化，具有方便、新穎、高效等優點。

本發明的有益效果：本發明采用生物特異性耦聯的方法，將單克隆或多克隆抗體固定于磁性微球載體上，得到可用于分離純化和固定化酶的免疫磁性微球；通過免疫磁性微球，無須對樣品進行復雜的前處理，可以直接從細胞裂解液中，一步分離純化和固定化目的酶，大大簡化操作步驟。該免疫磁性微球可多次重復使用，提高了效率降低了成本。本發明不同與傳統方法，為一種簡便、快速、高效的酶分離純化和固定化的新技術。

【附圖說明】