[發(fā)明專利]雞γ－干擾素在重組桿狀病毒中的表達及抗病毒活性的測定

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710056442.8
• 申請日: 2007-01-12
• 公開（公告）號: CN101221176A
• 公開（公告）日: 2008-07-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李守軍;步志高;李旭東;鮑恩東;趙莉
• 申請（專利權(quán)）人: 天津瑞普生物技術(shù)集團有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;C12Q1/68
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域，涉及雞γ-干擾素在重組桿狀病毒中的表達及其抗病毒活性的測定

背景技術(shù)

干擾素(Interferon，IFN)是在特定的抗原刺激下由細胞分泌的一類具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能等生物活性的糖蛋白，是發(fā)現(xiàn)最早，研究最多的細胞因子。根據(jù)IFN的細胞來源和結(jié)合受體不同，將IFN分為I型和II型。I型IFN主要有α、β兩個亞型，分別主要由淋巴細胞和成纖維細胞產(chǎn)生^[1]，它們作用于同一受體，可抑制病毒DNA復(fù)制和蛋白質(zhì)合成，活化NK細胞，促進MHC?I類分子提呈抗原。II型IFN為γ-干擾素，主要由T細胞和NK細胞產(chǎn)生^[2]，與I型IFN相比有多種免疫學(xué)活性，具有促進MHC?II類抗原表達、增強APC細胞與T細胞的相互作用、增強輔助T細胞和細胞毒性T細胞的產(chǎn)生等諸多免疫調(diào)節(jié)活性，既可以單獨作為生物制劑應(yīng)用于疾病的防治，也可作為免疫佐劑增強疫苗的免疫效果^[3～4]。雞γ-干擾素(Chicken?interferon-γ，ChIFN-γ)全基因為495個堿基，編碼164個氨基酸，前19個氨基酸為信號肽，后145個氨基酸為成熟多肽，含有兩個糖基化位點^[5]，成熟的蛋白質(zhì)為2條145個氨基酸的多肽鏈組成的同源二聚體^[6～7]，具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多方面的生物學(xué)活性^[8]。

1995年Digby等首先克隆出ChIFN-γ基因，此后國內(nèi)外學(xué)者利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組ChIFN-γ的研究隨之開始興起。迄今為止，ChIFN-γ基因已在大腸桿菌^[9]、猴腎細胞、成纖維細胞^[10]等細胞中獲得表達。與原核表達系統(tǒng)相比，桿狀病毒表達系統(tǒng)可以對外源蛋白進行多種翻譯后加工和修飾，表達重組蛋白更接近天然結(jié)構(gòu)。為此，本研究采用BAC-TO-BAC桿狀病毒表達系統(tǒng)(BAC-TO-BAC?Baculovirus?Expression?System)對ChIFN-γ全基因進行了表達，構(gòu)建含有ChIFN-γ完整開放閱讀框的重組桿狀病毒，感染sf9細胞表達出具有高效抗病毒活性的rChIFN-γ。我國是養(yǎng)雞大國，每年因病毒性疾病的爆發(fā)給養(yǎng)雞業(yè)帶來巨大損失，研制出具有高效抗病毒活性和免疫調(diào)節(jié)活性的基因工程rChIFN-γ無疑在雞病防治上具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的：采用BAC-TO-BAC桿狀病毒表達系統(tǒng)(BAC-TO-BACBaculovirus?Expression?System)對ChIFN-γ全基因進行了高表達，構(gòu)建含有ChIFN-γ完整開放閱讀框的重組桿狀病毒，感染昆蟲細胞表達出具有高效抗病毒活性的重組ChIFN-γ。

為了達到本發(fā)明的目的，采用BAC-TO-BAC桿狀病毒表達系統(tǒng)(BAC-TO-BAC?Baculovirus?Expression?System，由美國Gibco?brl公司開發(fā))對IFN-γ全基因進行了表達：構(gòu)建含有IFN-γ完整開放閱讀框的重組桿狀病毒，感染昆蟲細胞表達IFN-γ，通過間接IFA和間接ELISA方法，證實目的蛋白在昆蟲細胞中獲得表達。并采用VSV*GFP-CEF細胞系統(tǒng)通過感染復(fù)制抑制試驗測定重組雞IFN-γ抗病毒活性，達到2×10⁵IU/ml。

發(fā)明效果：

(1)目的蛋白表達的高效性：選用昆蟲細胞優(yōu)勢密碼子對GENEBANK中提交的雞IFN-γ基因序列進行密碼子優(yōu)化，以便目的蛋白在桿狀病毒-昆蟲細胞中高效表達；

(2)目的蛋白獲得的時效性：Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)中重組病毒的篩選是在大腸桿菌中進行，利用抗性基因和PCR篩選，并采用桿狀病毒穿梭載體技術(shù)，如此大大縮短了病毒純化和鑒定的時間，使原來的幾個月時間縮短到幾周，大大縮短了實驗時間；

(3)桿狀病毒表達系統(tǒng)是目前頗受歡迎的一種表達系統(tǒng)，它可以進行多種翻譯后修飾作用，包括糖基化、脂肪酸酰化、氨基末端乙酰化、羧基末端酰胺化和信號肽的切割、轉(zhuǎn)運，所表達蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上與天然蛋白比較接近。重組桿狀病毒感染昆蟲細胞表達的重組IFN-γ進行了多種翻譯后加工和修飾作用，產(chǎn)物和天然IFN-γ一樣可以進行分泌型表達，具有較高的生物學(xué)活性。

(4)生物安全性：桿狀病毒具有高度的種屬特異性，僅感染昆蟲，對脊椎動物無感染性，其表達產(chǎn)物安全可靠。