[發明專利]雞γ－干擾素在重組桿狀病毒中的表達及抗病毒活性的測定

無效

• 申請號: 200710056442.8
• 申請日: 2007-01-12
• 公開（公告）號: CN101221176A
• 公開（公告）日: 2008-07-16
• 發明（設計）人: 李守軍;步志高;李旭東;鮑恩東;趙莉
• 申請（專利權）人: 天津瑞普生物技術集團有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.雞γ-干擾素在重組桿狀病毒中的表達，其特征在于將GeneBank中提交的雞γ-干擾素基因序列進行密碼子優化并人工合成得到pMD-18T-ChIFN-γ，EcoR?I和Sal?I雙酶切pMD-18T-ChIFN-γ，將編碼ChIFN-γ基因DNA克隆至pFastBac^TM1，構成pFastBac^TM1-ChIFN-γ；將pFastBac^TM1-ChIFN-γ轉化DH_10Bac，提取質粒，PCR篩選陽性重組桿狀病毒基因組克隆rBacmid-ChIFN-γ，制備陽性重組基因組克隆DNA，采用Cellfectin^RReagent(Invitrogen)轉染sf9細胞，待細胞出現病變后，按文獻^[12]介紹的方法進行重組病毒嗜斑純化和病毒擴增，蛋白酶K-SDS-酚/氯仿抽提病毒基因組DNA，M13-48f(5’GTTTTCCCAGTCACGAC3’)和M13-47r(5’CAGGAAACAGCTATGAC3’)為引物PCR驗證ChIFN-γ基因在純化病毒中獲得穩定重組，重組病毒命名為rBac-ChIFN-γ；

上述rBac-ChIFN-γ種毒液按1∶10體積比感染新鮮制備sf9細胞，至細胞病變達90％時，收獲細胞用PBS洗滌重懸后滴于載玻片上，自然陰干后95％乙醇固定，同時設野生型桿狀病毒感染細胞為陰性對照。分別以1∶100稀釋鼠抗原核表達重組ChIFN-γ免疫血清和相同倍數稀釋的非免疫小鼠血清為一抗；PBST(0.05％Tween20)洗滌后加入1∶50倍稀釋熒光素(FITC)標記的羊抗鼠IgG為二抗，作用30min，PBST洗滌后熒光顯微鏡觀察結果。

2.根據權利要求1所述的雞γ-干擾素在重組桿狀病毒中的表達，其特征在于其抗病毒活性的測定采用VSV*GFP-CEF細胞系統測定重組ChIFN-γ抗病毒活性，以2×10⁴cells/孔密度將CEF鋪于24孔板，待細胞貼壁后，加入2×10～2×10⁶不同稀釋倍數的重組ChIFN-γ(rBac-ChIFN-γ感染sf9細胞的培養上清)，37℃作用過夜。100pfu/孔VSV*GFP感染細胞，1小時后換完全培養液，24小時后熒光顯微鏡觀察結果，以熒光亮度為對照孔50％的最高稀釋度為一個單位(IU)。