[發明專利]真空滲透輔助大豆未成熟子葉再生體系的高效遺傳轉化方法

無效

• 申請號: 200710056131.1
• 申請日: 2007-10-10
• 公開（公告）號: CN101173297A
• 公開（公告）日: 2008-05-07
• 發明（設計）人: 趙桂蘭;郭東全;楊向東;錢雪艷
• 申請（專利權）人: 吉林省農業科學院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N5/10;A01H4/00
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司
• 代理人: 陳宏偉

技術領域：

本發明涉及植物基因工程領域，公開一種真空滲透輔助大豆未成熟子葉再生體系的高效遺傳轉化方法，從而改良大豆遺傳性狀的操作方法。

背景技術：

大豆的遺傳轉化一直是植物基因工程領域的難點之一，雖然也有不少成功得到大豆轉基因植株的報道，但是大豆遺傳轉化一直沒有突破性的進展。究其原因，最重要的一點就是轉化率沒有顯著提高。

目前應用于大豆遺傳轉化的方法主要分為兩類：1、直接法：主要包括基因槍法、花粉管通道法、電擊法、微注射法等；2、載體法：主要包括根癌農桿菌介導法。其中獲得廣泛應用的只有基因槍法和根癌農桿菌介導法。即使這兩種方法在應用中也有一定的局限性。如何真正實現大豆的高效轉化仍然是該領域所面臨的主要問題。

農桿菌轉化法采用的受體材料大多為子葉節，這一系統由Cheng等用無菌苗子葉節首次報道成功再生植株。這個系統相對于其他不定芽和體細胞系統有其一定的優點，但由此系統獲得的植株嵌合體多，后期篩選工作量較大。

大豆體細胞胚再生系統首次獲得再生植株是由Christianson在1983年報道的。其采用的外植體為胚軸，此后的報道采用的外植體大多為未成熟子葉和完整幼胚。但真正能應用于轉化的是Finer等所建立的系統，把未成熟子葉放在含40mg/L?2，4-D的MS培養基上誘導出體胚，胚性組織在繼代培養過程中可在誘導培養基或含低水平2，4-D的液體懸浮培養基上增殖。組織學分析表明，新生胚分布在舊胚表面，易于進行轉化，而且可在液體培養基中進行篩選，這樣由于篩選介質與可增殖胚的高面積接觸而使篩選變得高效，從而可以克服嵌合體的問題。此后許多實驗室都采用這一系統獲得了非嵌合的轉基因植株。其中Stewart于1996年報道了其把Bt基因導入大豆并獲得了抗蟲害的轉基因植株。

發明內容：

本發明公開一種真空滲透輔助大豆未成熟子葉再生體系的高效遺傳轉化方法，的目的在于克服現有大豆遺傳轉化效率低的難點，采用大豆未成熟子葉作為外植體，在根癌農桿菌介導的方法中提供一種利用真空滲透輔助轉化外源DNA的方法。

本發明的具體方法包括以下步驟：

一、大豆未成熟子葉體細胞胚的誘導及增殖：

采用20～40mg/L?2，4-D誘導的方法在暗培養條件下得到大豆未成熟子葉體細胞胚胎，并使其進一步增殖為子葉型胚體，將子葉型胚體轉入空培養皿中25℃光照條件下進行干燥培養。

二、真空滲透輔助導入外源DNA：

將干燥處理5-7天的胚體浸入根癌農桿菌液(OD600＝0.5)中，快速抽真空至-23Hg條件下感染5～15分鐘。轉入1/2MS培養基+蔗糖30g/L+5.5g瓊脂粉(pH＝6.5～7.0)中共培養3天。

三、轉基因植株的獲得：

共培養后的外植體放在1/2MS培養基附加抑菌劑的固體培養基上進行培養，每2周繼代一次，當抗性胚體萌發小植株時，轉入1/2MS培養基+0.3～0.5mg/L?NAA附加相應抗生素的培養基上進行生根培養；當長出發育良好的根莖后進行練苗移栽。

本發明的積極效果在于：采用了真空滲透輔助農桿菌介導的方法，在一定的真空條件下、一定時間處理后，能夠在大豆體細胞胚上制造許多微小傷口，充分提高了農桿菌入侵機會，明顯提高了農桿菌的感染效率，與普通農桿菌介導法相比，顯著提高了大豆的轉化率。另外，本發明采用大豆未成熟子葉作為外植體進行遺傳轉化，避免了采用子葉節作為外植體進行轉化時容易產生嵌合體的問題。

附圖說明

圖1為實施例1轉反義PEP基因高油大豆部分植株的RT-PCR；

1：陽性對照質粒；2：陰性對照；3～8：轉基因大豆；M：分子量Marker

圖2為實施例1轉反義PEP基因高油大豆部分植株的Southern?blotting檢測；

M：分子量Marker；+：質粒；-：陰性對照(未轉基因大豆)P1-P3：轉反義PEP基因大豆；

圖3為實施例2大豆轉雙價Bt基因植物的PCR分析；

1：分子量Maker；2：質粒DNA；3：：陰性對照；15：非轉基因材料；4-14，16-20：轉基因材料

圖4為實施例2轉抗蟲基因大豆部分植株的Southern?blotting檢測(HindIII酶切)；M：分子量Maker；+：陽性質粒；-：陰性對照(未轉基因植株)；1-4：轉基因植株

具體實施方式