[發明專利]真空滲透輔助大豆未成熟子葉再生體系的高效遺傳轉化方法

無效

• 申請號: 200710056131.1
• 申請日: 2007-10-10
• 公開（公告）號: CN101173297A
• 公開（公告）日: 2008-05-07
• 發明（設計）人: 趙桂蘭;郭東全;楊向東;錢雪艷
• 申請（專利權）人: 吉林省農業科學院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N5/10;A01H4/00
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司
• 代理人: 陳宏偉

1.一種真空滲透輔助大豆未成熟子葉再生體系的高效遺傳轉化方法，其特征在于：所用的外植體為大豆未成熟子葉。

2.如權利要求1中所述的轉化方法，包括如下步驟：

1)大豆未成熟子葉體細胞胚的誘導及增殖：

采用20～40mg/L?2，4-D誘導的方法在暗培養條件下得到大豆未成熟子葉體細胞胚胎，并使其進一步增殖為子葉型胚體，將子葉型胚體轉入空培養皿中25℃光照條件下進行干燥培養；

2)真空滲透輔助導入外源DNA：

將干燥處理5-7天的胚體浸入根癌農桿菌液(OD600＝0.5)中，快速抽真空至-23Hg條件下感染5～15分鐘；轉入1/2MS培養基+蔗糖30g/L+5.5g瓊脂粉(pH＝6.5～7.0)中共培養3天；

3)轉基因植株的獲得：

共培養后的外植體放在1/2MS培養基附加抑菌劑的固體培養基上進行培養，每2周繼代一次，當抗性胚體萌發小植株時，轉入1/2MS培養基+0.3～0.5mg/L?NAA附加相應抗生素的培養基上進行生根培養；當長出發育良好的根莖后進行練苗移栽。

3.如權利要求1中所述的轉化方法，包括如下步驟：

(a)取開花后20天左右的大豆幼莢，用75％的酒精表面滅菌；

(b)將子葉去掉胚軸，近軸面向上接種于MS培養基+2，4-D?20mg/L+蔗糖3.0g/L+植物凝膠3.0g/L，pH＝6.0，黑暗條件下培養14-30天；

(c)選取色澤明亮并呈球形的綠色胚狀體，移至MS培養基附加2，4-D5.0mg/L+天門冬酰胺1.0g/L+蔗糖3.0g/L+植物凝膠3.0g/L(pH＝5.8)中，25℃光照培養，每兩周繼代一次；

(d)將體細胞胚轉到MS培養基+活性炭4.0g/L+麥芽糖60.0g/L+植物凝膠3.0g/L(pH＝6.4)上，25℃光照培養，每兩周繼代一次；

(e)將長出的子葉型胚體放入MS培養基+麥芽糖60.0g/L+植物凝膠3.0g/L(pH＝6.4)上，25℃光照培養；

(f)4～6周后，待子葉型胚體顏色轉變為奶油色將其轉入無菌的空培養皿中25℃光照條件下進行干燥培養；

(g)將干燥處理5-7天的胚體浸入根癌農桿菌液中，快速抽真空至-23Hg條件下感染10分鐘；轉入1/2MS培養基+蔗糖30g/L+5.5g瓊脂粉(pH＝7.0)中共培養3天；

(h)共培養后的外植體放在1/2MS培養基+頭孢霉素250mg/L+羧芐青霉素250mg/L+卡那霉素80mg/L+植物凝膠3.0g/L(pH7.0)培養基上進行培養，每2周繼代一次，當抗性胚體萌發小植株時，轉入1/2MS+NAA0.5mg/L+頭孢霉素250mg/L+羧芐青霉素250mg/L+卡那霉素100mg/L+植物凝膠3.0g/L(pH7.0)中進行生根培養；當長出發育良好的根莖后進行練苗移栽。