[發(fā)明專利]植物根內(nèi)生防細菌的快速、高效篩選方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710056057.3
• 申請日: 2007-09-11
• 公開（公告）號: CN101148647A
• 公開（公告）日: 2008-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李春杰;許艷麗;馬光波
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20
• 代理公司: 長春科宇專利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 楊恕平

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。是一種為拮抗植物病原真菌的植物根內(nèi)生防細菌快速、高效篩選方法。

背景技術(shù)

全國各地每年都會因植物病害引起植株矮小、瘦弱、黃化等不同癥狀，嚴重時全株死亡，造成巨大的經(jīng)濟損失，其中有80％病害屬于真菌病害。在防治方面，化學(xué)防治雖然見效快，但易造成農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染，對人們身體健康產(chǎn)生潛在的威脅；同時化學(xué)農(nóng)藥的長期使用，病原菌也易對其產(chǎn)生抗藥性因而導(dǎo)致防治效果下降。細菌存在范圍廣，種類多，數(shù)量大，繁殖快，它們中有的能產(chǎn)生拮抗性物質(zhì)，抑制病原菌，并且促進植物的生長，所以利用細菌防治植物病害，尤其是土傳病害，具有很大的潛力。隨著人們生活水平的提高，對食品安全性要求也在不斷地提高，篩選出可替代化學(xué)藥劑防治植物病害的生防制劑成為迫切需要。

國內(nèi)外很多學(xué)者研究證明，有許多種拮抗性細菌具有防治植物病害尤其是土傳病害的能力，常見的有以下一些屬：芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸桿菌屬(Enterobaeter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、黃桿菌屬(Flazobacterium)、哈夫尼菌屬(Hafnia)、小單孢菌屬(Micromonspora)、假單胞菌屬(Pseu.domonas)、固氮菌屬(Azotobacter)、根瘤菌屬(Rhizobium)、沙雷氏菌屬(Serratia)、鏈霉菌屬(Streptomyces)和黃單胞菌屬(Xanthomonas)。有的生防細菌不僅具有防病作用，同時還可以提高種子的發(fā)芽率，還有明顯的增產(chǎn)效應(yīng)。

目前，生防細菌的篩選普遍采用的步驟是，首先將植物組織研磨采用稀釋涂布平板法分離組織內(nèi)能培養(yǎng)的絕大多數(shù)細菌，取單個菌落在平板上不斷劃線純化后，與病原真菌平板對峙培養(yǎng)進行篩選。如果從土壤中分離，則先稀釋土壤懸浮液采用稀釋涂布平板法或稀釋混合平板法分離土壤中適合該培養(yǎng)基的所有細菌，純化后進行平板一一對峙培養(yǎng)或點接法培養(yǎng)進行篩選。工作量較大，重復(fù)工作較多，試驗過程中需要的培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿量大，篩選到有生防效果的細菌概率較小，即耗時耗材。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是高效篩選防治植物真菌病害尤其是土傳病害的植物根內(nèi)生防細菌，以達到縮短生防細菌的篩選階段，加快生防細菌的開發(fā)和應(yīng)用，使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐中植物病害得到很好的控制。本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)是對已有的傳統(tǒng)分離、篩選方法，進行了改進，采用改進的TY培養(yǎng)基，稀釋平板法分離細菌，在另一Ch+TY平板上均勻地涂上病原真菌懸浮液，然后接種菌落形狀、大小和顏色不同的10個細菌菌落進行培養(yǎng)，觀察真菌周圍是否有抑菌帶出現(xiàn)，有抑菌帶出現(xiàn)的即為目標(biāo)細菌。改目前的先稀釋平板法分離然后多次重復(fù)一一對峙培養(yǎng)篩選為病原真菌涂布平板十對一培養(yǎng)法篩選。使生防細菌對病原真菌的拮抗能力明顯增強，并且時間短，根內(nèi)生防細菌的篩選較傳統(tǒng)篩選法節(jié)省15d左右。該方法耗材少，工作量小，僅用傳統(tǒng)方法的四分之一的材料，五分之一的工作量，篩選到的細菌田間應(yīng)用防治效果明顯提高。

具體方法如下：

1.細菌分離

TY培養(yǎng)基的配制(適合多數(shù)細菌生長)：

Lactalbumin?hydrolysate??2g

Yeast?Extract????????????0.2g

CaCl₂????????????????????0.04g

Bacto-Agar???????????????2.4g

Distilled?H₂O????????????200ml

高壓滅菌?????????????????15min

分離步驟：

1)取約0.1g干植物根，至于表面用酒精消毒的研缽中；

2)加入1ml?MgSO₄緩沖液，將根樣研磨成勻漿；

3)三支試管分別裝入0.9ml?MgSO₄緩沖液；

4)準(zhǔn)備三個TY平板，培養(yǎng)皿背面標(biāo)好日期和稀釋度10^-2、10^-3、10^-4

5)取0.1ml研磨的勻漿，置于第一支試管中；換一另支槍頭，混勻，從中取0.02ml置于TY平板上，用此槍頭再取0.1ml置于第二支試管中；再換一另支槍頭，混勻，從中取0.02ml置于另一TY平板上，依次作三個平板；

6)將三角玻璃棒浸入酒精中稍許，于酒精燈上燃燒，重復(fù)兩次；